1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一．课题意义黄酮类化合物是发现的目前植物次生代谢物中最大的一类化合物，有着多种调节人体生理功能的特性[1-6]。
黄酮类化合物结构多样，很多都有着非常复杂的手型结构和相应的活性基团，很难用化学法进行合成得到此类化合物。
其生物合成机制已经被探明，并且其生物合成方法近年来已经通过重组微生物实现了生产工程化[7,8]。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：通过改造工程大肠杆菌体内乙酰辅酶a羧化酶基因，提高柚皮素生物合成产量研究内容：1.培养绿脓假单胞杆菌菌株，获得其基因组，设计引物并确定酶切位点；2.将绿脓假单胞杆菌的乙酰辅酶a羧化酶基因paacc切割下，并利用pcr技术进行扩增，再将paacc与t质粒载体连接，导入工程大肠杆菌菌株培养；3.利用抗性物质amp筛选出含t-paacc基因的菌株，再将paacc片段从t-paacc基因上切割下来与氯霉素抗性pacycduet-1连接，后导入含esi及ctnt4基因的表达菌株中，用含抗性物质clo的培养基培养，筛选出含a-paacc的菌株；4.将含a-paacc的表达菌株用发酵培养基培养，并观察其柚皮素的产量变化。
关键问题：1.引物和酶切位点的设计；2.paacc基因的提取；3.paacc基因与载体的连接，paacc基因与pacycduet-1抗性基因的连接；4.t-paacc以及a-paacc的导入；5.过程菌株及表达菌株的培养；6.发酵培养基的设计与配置，菌株发酵培养条件的控制；7.菌株的接种及表达菌株的发酵。
柚皮素产量的确定
3. 研究的方法与方案
一．研究方法及技术路线将绿脓假单胞杆菌中乙酰辅酶a羧化酶基因paacc通过基因工程技术转入工业大肠杆菌菌株中，来提高柚皮素生物合成产量。
1.活化菌株向5mllb培养基中按1%接种量接入原始菌株，加入相应抗生素，37℃，200rpm培养12h。
2.质粒提取取培养过夜的菌体约3ml于离心管中，12000rmp室温离心1min，去上清。
4. 研究创新点
1.生物合成法的优势：生化合成法不仅可以使某些天然产物更容易获得，而且可以使他们的化学性质更加多样化。
因此，将以大肠杆菌为代表的工程微生物用作表达载体并进行黄酮合成路径设计、优化，是实现其大规模实现生产的有效方法。
2.大肠杆菌的优势：目前大肠杆菌作为最常见的工程菌得到广泛运用，以大肠杆菌这一了解得较深入的菌株作为转化的宿主，可以经济有效地调控发酵条件，使得最终产物产量最大化3.基因前处理：对目的基因所在基因组进行提前测序，有利于质粒的构建，酶切位点的确定以及目的基因的表达。
5. 研究计划与进展
研究计划：2017年9月-2017年10月：完成课题的确认、查阅相关文献设计实验。
同时，进入实验室进行相关实验技术操作的训练，熟悉设备，了解实验原理。
进行一部分的预实验。
