1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题的意义：卤化化合物具有结构的多样性,已被广泛应用于工农业生产和人类疾病防治领域。
卤元素的添加通常可以增强化合物的生物活性,但由于缺少底物的特异性和区域选择性使得通过传统化学合成的方法获得这些卤化物较为困难;另一方面,越来越多的研究显示许多微生物可通过自身代谢产生卤化物,这些化合物的生物合成需要卤化酶的参与。
利用卤化酶中的保守序列设计简并引物通过pcr的方法获得编码卤化酶的生物基因序列，为获得含卤化酶的天然产物基因簇打下基础，最后通过生物合成的方法获得具有生物活性的卤化物。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标:通过宏基因组的方法构建文库，设计简并引物，筛选阳性克隆获得具有编码卤化酶保守序列的基因序列，最后用来比对已知的卤化酶序列，相似性为40%-50%的序列即有可能是一种新的卤化酶生物合成基因序列。
研究的内容：① 根据卤化酶的保守序列设计简并引物② 通过简并引物筛选阳性克隆③ 测序后比对已知卤化物生物合成基因拟解决的关键问题：筛选单克隆时出现的假阳性现象和最后确定到单孔后挑菌做菌落PCR时挑到阳性单克隆菌落的概率问题。
3. 研究的方法与方案
研究方法：利用土壤宏基因组的方法，从土壤样品中提取全部微生物构建宏基因组文库，筛选具有卤化酶的天然产物生物合成基因技术路线：① 建立基因文库② 设计简并引物③ 筛选阳性克隆实验方案：首先建立基因文库，实验室已经从土壤中取样建立了3号文库；然后设计简并引物分析已知几种生物合成基因序列的卤化酶获得卤化酶的保守序列，通过卤化酶的保守序列设计简并引物；最后利用设计的简并引物做多次pcr筛选文库获得阳性的单克隆菌落，测序后对比分析卤化酶的基因序列。
多次pcr筛选文库获得阳性的单克隆菌落步骤：⒈取50ul二代菌液 1ml含amp的lb培养液，稀释100ul到1ml含amp的lb培养液，继续稀释100ul到1ml含amp的lb培养液；2.取200ul到40ml含amp的lb培养液，每孔100ul铺4块96孔板37℃培养20h；3.对4块96孔板进行混合，每板混合成1列8个，利用重新设计的引物pcr筛选；4.定位到哪一板哪一行有相应片段，对此进行12个pcr；5.定位到某个孔含有对应片段，单孔 100ul含amp的lb培养液；6.取10ul到1ml含amp的lb培养液，剩余保菌，之后稀释3次，每次取前一次100ul 1ml含amp的lb培养液，并编号1.2.3.4；7.取3号和4号100ul铺平板培养20h；8.挑单克隆菌落做菌落pcr，筛选阳性克隆。
附： 20ul pcr体系 菌落pcr体系250bpmix10ul 10ul 水 6ul 7.1ul上游引物 0.8ul 0.8ul下游引物 0.8ul 0.8ul dmso0.8ul 0.8ul菌液1.6ul 挑菌
4. 研究创新点
土壤是微生物的大本营，但是由于极高的重复率，利用传统的纯培养技术筛选到新的生物活性物质的机率显著下降；而宏基因组学采用的是非培养的方法，因此突破了该瓶颈，一系列新的生物活性物质和基因利用该方法得以发现。
宏基因组学能直接获得土壤中的总dna 并进行分析。
基于dna 的宏基因组学理论上覆盖了土壤中的全部微生物，因此可以大大拓展了筛选新的基因的来源。
5. 研究计划与进展
2014年12月25日 至 1月6日 查找文献了解卤化酶并完成文献综述；2015年1月7日 至 1月13日 熟悉实验步骤； 2015年1月14日 至 3月31日 完成开题报告； 2015年3月13日 至 4月 设计简并引物并对文库菌进行多次RCR获得多组阳性单克隆； 2015年4月上旬 至 4月中旬 将获得的单克隆送交测序公司测序并完成中期报告； 2015年 4月中旬 至5月中旬 获得单克隆序列并比对已知的卤化酶序列 完成毕业论文； 2015年5月25日 至5月30日 毕业答辩
