1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
1.1本研究的目的意义 根据lox的作用特性,探索从自然界获得lox产生菌的筛选方法,从自然环境中筛选出产lox的新型菌株,研究lox的特性,拓宽lox在生物科技领域的应用。
1.2国内外研究概况 多年以来,一直认为lox只存在于真核生物中,lox在真菌中分布较广泛,如geotrichum candidum[1]、penicillium camemberti[2]、thermomyces lanuginosus[3]等。
真菌lox的主要底物为亚油酸或a-亚麻酸。
2. 研究的基本内容和问题
2.1 研究的目标 总结从自然界中筛选lox产生菌的方法,获得新的lox产生菌,检测出所产lox的粗酶特性2.2 研究内容 (1)脂肪氧合酶产生菌的分离筛选及鉴定 将lox活力的比色测定法应用到琼脂平板上,以筛选产lox的微生物。
antti nyyssl等已成功地将ki-starch显色法和吲达胺染料法应用到琼脂平板上,鉴定出了产胞外lox的三种转化子。
以目前所研究的原核lox来看,它的最适底物大部分为亚油酸(一种不饱和脂肪酸)。
3. 研究的方法与方案
3.1 研究方法 通过大批量平板筛选初步得到可能产lox的菌株,复筛,检测发酵液中可能存在的酶活性,可能性的菌株进行菌株鉴定,测定粗酶活性特点。
3.2 技术路线(见附件1-图1)3.3 实验方案3.3.1 lox粗酶液验证ki-starch显色法和吲达胺染料法的有效性 利用实验室保藏的一株基因工程菌(ana-lox)来生产lox粗酶液,验证ki-starch显色法和吲达胺染料法的有效性。
ki-starch显色法和吲达胺染料法均可用来测定lox的活力,原理分别如下:1)ki-starch法lox催化亚油酸生成亚油酸氢过氧化物,在酸性条件下,亚油酸氢过氧化物氧化i-形成i2,i2与淀粉结合形成有色物质。
4. 研究创新点
4 特色或创新之处根据LOX的作用特性,建立从自然环境中定向筛选产LOX的新型菌株的方法,获得新型LOX产生菌,研究产生的LOX性质,填补LOX产生菌筛选方法方面的空白。
5. 研究计划与进展
5 研究计划及预期进展5.1 研究计划 2013.9.1-2013.10.1 阅读相关文献,拟定实验方案 2013.10.1-2013.11.15进行小批量的预实验,总结实验中遇到的问题及可能的解决方案 2013.11.16-2014.1.15有序地进行实验,做好实验记录,对于实验过程中遇到的问题进行分析思考,提出解决方案并继续进行后续实验,预计可能筛选到几株产LOX产生菌 2014.2.17-2014.4菌株鉴定,摇瓶发酵,研究LOX的酶学性质 2014.5 -2014.5.20补充实验,撰写毕业论文 2014.5.25毕业答辩5.2 预期进展 2013.10 实验方案(初稿)定稿 2013.11 初步预实验 2014.2 筛选得到几株疑似LOX产生菌 2014.4 菌种鉴定完毕,酶活性初步研究结束 2014.5 撰写毕业论文,毕业答辩结束
