1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 课题的意义
沙门氏菌是一类在自然界中普遍存在，可在人和动物肠道中寄生生存，对人类和动物的生命健康造成很大危害，并能引起人畜共患病的革兰氏阴性病原菌。沙门氏菌的主要传播媒介是家禽、蛋、奶、肉类等营养丰富的畜禽产品，容易污染水源及食品，是导致人类食物中毒、肠胃炎和动物腹泻等疾病的主要食源性病原菌。用于检测沙门氏菌的方法有传统培养法、免疫学法、分子生物学方法等[1]。传统培养法虽可靠性高，但操作步骤比较繁琐，对工作人员和实验环境都有较高的要求，检测周期长，一般需要4~7d才能确定检测结果，不适合沙门氏菌的快速检测[2]。
近年来，国内外学者对免疫学和分子生物学进行了大量研究，结合传统培养法，研究和开发了一些快速、准确、灵敏度高等特点的沙门氏菌的快速检测方法。环介导等温扩增技术 ( loop-mediatedisothermal amplification, lamp ) 是notomi等[3]在2000年开发的一种新型的恒温核酸体外扩增技术，该方法与国标检测法相比具有灵敏度高、快速、简便的优点，较高的检出率也有助于对食品安全的严格控制[4]。
2. 研究的基本内容和问题
1 研究的目标
通过国标法、rt-pcr和可视化lamp三种检测方法，对人工污染样品和实际样品中沙门氏菌进行检测，对比三种方法的检测时间、检测准确性及检出率等各个方面，以期为即食果蔬中沙门氏菌的检测提供一种高效、便捷的方式。
2 研究内容
3. 研究的方法与方案
1 研究方法
主要检测方法：国标法、RT-PCR、可视化LAMP
基因提取方法：热裂解法
2 技术路线
图1 技术路线图
3 实验方案
（1）按照GB 4789.4-2016[16]中的方法处理样品并获得增菌液，用平板划线法初步判断样品中是否有沙门氏菌可疑菌落。
（2）采用热裂解法[17]提取菌株的基因组DNA，分别用RT-PCR法和可视化LAMP法对所有样品的基因进行特异性扩增，根据扩增曲线和显色结果判断是否含有沙门氏菌基因。
（3）结合分子检测结果和国标检测结果，挑取可疑菌落，按照国标指导书上生化鉴定步骤最终确定结果。
表1 可视化LAMP 20μL体系
| 试剂 | 体积（μL） |
| F3/ B3 | 0.4 |
| FIP/ BIP | 1.6 |
| LF/ LB | 0.8 |
| dNTPs Mg2 10×ThermoPolbuffer Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶 DNA模板 钙黄绿素指示剂 | 0.36 0.4 2 1 2 1 |
表注：体系加水补足20μL；
10×ThermoPolbuffer：20 mM Tris-HCl，50 mM KCl，10mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1% TritonX-20，pH8.8，25℃。
表2 可视化LAMP扩增引物
| Primer | Sequence (5’-3’) | G C (%) | Tm (°C) |
| F3 | CATACAGGCTGCCTGTTCTG | 55 | 55.7 |
| B3 | CGCCGTATACCTTCAGTACC | 55 | 54.7 |
| FIP | TTCACGGGGACGCAGACACATTGCAGCAATTACGTCGGA | 53.8 | 71.8 |
| BIP | TTCCCTGAGACAGATCCTGCCGCGGTCGCTGAAAAACAACTC | 54.8 | 72.0 |
| LF | GTATCAGTATGGCCTCCGG | 57.9 | 54.0 |
| LB | CCCGGTTATGATTATCAGCG | 50 | 53.3 |
表3 RT-PCR（沙门氏菌属）20μL体系
| 试剂 | 体积（μL） |
| SC962-f/ SC962-r | 0.4 |
| 10×PCRBuffer | 2 |
| dNTPs | 1.2 |
| TaKaRa Ex Taq HS enzyme Ly Green荧光染料 石墨烯量子点 DNA模板 | 0.1 0.5 1 2 |
表注：体系加水补足至20μL。
表4 RT-PCR（肠炎沙门氏菌） 20μL体系
| 试剂 | 体积（μL） |
| SEP-f/ SEP-r | 0.4 |
| 10×PCRBuffer | 2 |
| dNTPs | 1.2 |
| TaKaRa Ex Taq HS enzyme Green荧光染料 石墨烯量子点 DNA模板 | 0.1 2 1 2 |
表注：体系加水补足至20μL。
表5 Real-time PCR扩增引物
| Target gene | Primers | Length | Sequence (5’—3’) | Product (bp) |
| gene62181533 | SC962-f | 18 | GGAACTGGCGGAGATACT | 239 |
| SC962-r | 18 | CCTGAAGCAAGCGTAACT | ||
| SEN1383 | SEP-f | 20 | TCATTAGATCGGCCAAATCC | 104 |
| SEP-r | 20 | TTTGAACGGTAAGGCACCTC |
4 可行性分析
从实验方案来看，按照GB 4789.4-2016中的方法对样品进行处理得到增菌液，再用热裂解法提取基因，最后用可视化LAMP法和RT-PCR法对所得基因进行扩增，以上实验方法均具有可操作性且成熟。
实验过程中对于沙门氏菌的处理都是在二级生物安全实验室中进行的，严格按照实验室规定进行实验操作，并对实验垃圾严格按照规定来灭菌。实验方案中所用的染色剂和显色指示剂都是对人体无毒无害的。
4. 研究创新点
通过研究建立起来的环介导等温扩增检测沙门氏菌体系灵敏度比较高，并且操作简单，不需要昂贵的pcr仪。
对于核酸扩增方面，可视化lamp技术比pcr技术灵敏、省时、方便、经济，用于检测即食果蔬中沙门氏菌更方便、快捷。
相比于国标法，可视化lamp技术检测时间大大缩短，而且节省了大量的人力、物力。
5. 研究计划与进展
2019年9月 查阅资料，深入了解课题，规划实验进度。
2019年10月-2020年4月 人工污染样品和实际样品国标法、rt-pcr法、可视化lamp法检测。
2020年5月-2020年6月 进行数据整理分析，完成论文写作与答辩。
