漆酶大肠杆菌工程菌发酵优化开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.课题意义

漆酶是一种结合多个铜离子的多酚氧化酶，在生物技术领域中被认为是最终的“绿色催化剂”^[1]，被广泛应用在食品、造纸、生物燃料、纺织和精细化学品等多个领域工业。但天然细菌漆酶产量很低、异源功能表达、催化活力、热稳定性、对非天然介质的耐受性，并且细菌漆酶在大肠杆菌中倾向于胞内表达，这给之后的纯化工艺带来了很多的不便捷性，大大增加了纯化的成本，对细菌漆酶的产业化应用具有很大限制性。为提高细菌漆酶产量，异源表达技术被广泛应用。还有其他策略，例如：优化发酵条件、高细胞密度培养、利用定向诱变、自诱导、超声与低温物理胁迫、乙醇两性特性作用、乙酸水平调节策略等。本课题利用曲拉通两性特性作用，定向进化技术实现细菌高产量。

2.国内外研究进展

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

通过曲拉通两性特性作用，和定向进化技术，实现细菌漆酶高效表达，提高酶产量，优化酶学性质，降低酶的生产成本，使其达到工业化生产水平。

1.2研究内容

3. 研究的方法与方案

1.研究方法及技术路线

研究方法包括文献搜集查找、预实验准备、漆酶的发酵纯化及酶学性质测定等。

技术路线如下：

4. 研究创新点

1.利用曲拉通两性特性作用，诱导大肠杆菌胞外表达漆酶，为后续提取分离简化了步骤，同时提高了表达量，实现漆酶工业化规模生产。

2.同于基于易错PCR得定向进化技术，筛选有利突变体，增强了漆酶得异源表达量，提高催化活性，应用于更多领域。

5. 研究计划与进展

2019.9—2019.11：查阅文献及相关书籍资料，对漆酶得当前研究有大致了解，撰写文献综述；

2019.11—2020.1：完成曲拉通发酵优化，找到曲拉通最适添加量以及添加时间。

2020.3—2020.4:利用定向进化技术，筛选有利突变体，进行突变酶分离纯化，以及酶学性质测定分析。