优化新型混合碳源发酵生产ε-聚赖氨酸研究开题报告

1．本课题研究的背景、目的及意义

1.1背景和目的

ε-聚赖氨酸（ε-poly-Lysine，ε-PL）是少数链霉菌将L-赖氨酸单体通过α-COOH与ε-NH2脱水缩合而成的一种氨基酸同聚物，聚合度为25-35。由于其抑菌谱广、效价高、安全无毒，再配合其水溶性好、作用pH广、热稳定强等特点，ε-PL已被广泛用作食品防腐剂。

ε-PL热稳定性非常好,即使把聚赖氨酸水溶液加热至100e处理30min或120e处理20min后,也不会发生分解现象,仍保持原有聚合物的长度。聚赖氨酸能够承受一般食品加工过程中的热处理,可以随原料一同进行灭菌处理,防止二次污染。

ε-PL安全性很高，能在人体内分解为赖氨酸,而赖氨酸是人体必需8种氨基酸之一,也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。它具有较为广谱的抑菌效果，对于大部分能引起食物中毒与腐败的微生物有强烈的抑制作用。这是这种安全而又广谱的抑菌效果，使得ε-PL成为现在研究防腐剂的热门方向。

本研究的目的在于通过单因素和响应面分析方法来优化发酵培养基，确定最合适的碳源复配比例，从而最大限度的发挥突变菌株代谢生产ε-PL的特性，提高ε-PL的产量。

1.2研究意义：

从事食品工业的人都知道，现代大规模的食品工业都是建立在食品添加剂基础之上的，其中防腐剂是最为重要的一类，这是因为食物从原料到餐桌往往要经过一定的货架期，防腐保鲜具有不可替代的作用。目前国际上批准使用的食品防腐剂种类很多，但使用规模最大的是化学防腐剂，化学防腐剂价格便宜且容易获得，虽然经过了严格的毒理学评价，按规定使用对人体无害，但也毕竟无益，特别是市场机制不规范，超标使用现象屡见不鲜，会对人体产生危害，甚至致癌。由于这些原因，微生物来源的防腐剂越来越被人重视，目前使用的微生物源防腐剂有纳他霉素（Natamycin）、乳酸链球菌素（Nisin）、ε-聚赖氨酸（ε-PL）等。ε-聚赖氨酸（ε-PL）由于其较高的安全性和广谱的抑菌性，使其成为研究的焦点，迄今为止，只有日本窒素公司（ChissoCorporation）形成了年产千吨级ε-PL的工业化生产规模，其发酵水平在2001年就达到了48.3g/L，每年仅在日本就有十几亿日元的市场份额，中国人口是日本人口的数十倍，潜在的市场价值十分可观。

1.3应用

（1）ε-PL在食品中的应用

ε-PL具有很广的抗菌谱，对生长的细菌最小抑菌浓度在100pgml-1以下。ε-PL能引起人们广泛的关注就在于可以作为食品保鲜剂，具有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好、抑菌pH范围广等特点。ε-聚赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体必需8种氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化氨基酸。因此ε-聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，安全性高于其它化学防腐剂。

①酒精制剂：以含50％ε一聚赖氨酸的糊精粉末为基础原料，添加30％～70％的酒精的制剂，主要用于各种蛋制品。研究发现，将无水乙醇或含水乙醇与￡一聚赖氨酸盐混合能明显抑制酵母生长。

②有机酸制剂：添加有机酸如：醋酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸等，添加量为0．5％～5．0％。其中￡一聚赖氨酸与醋酸对枯草芽孢杆菌有明显的抑制作用。主要用于米饭、饮料、色拉、酱类等食品。

③甘油酯制剂：甘油酯为低级脂肪酸酯，添加量为0．01％～5％。主要用于含有动物性蛋白、乳蛋白较多的食品。

④甘氨酸制剂：甘氨酸本身就是一种抑菌剂，其和ε一聚赖氨酸复合使用，协同抑菌效果更佳。甘氨酸添加量为O．O1％-10％。

（2）ε-聚赖氨酸在医药研究中的应用

ε-PL在医药方面主要应用于药物的缓释和靶向载体。由于ε-PL富含阳离子，与带有阴离子的物质有很强的静电作用力且很容易通过生物膜，可以降低药物的阻力并提高药物的转运效率。可将ε-PL用作某些药物的载体，已在医疗和制药方面得到广泛的应用。ε-PL研究表明，其在兔子和啮齿动物中，双链RNA多聚肌甘酸－多聚胞甘酸（polyI.polyC）作为内源性干扰素诱导物是很有效的，因此polyI.polyC可以作为抗病毒和抗肿瘤制剂。

由于ε-PL是阳离子型高聚合物且有很强的抗菌性和抗病毒能力，因此有望开发成抗菌纤维。将ε-PL与海藻酸盐复合体做成缓释胶囊的包被膜，通过ε-PL改变海藻酸盐膜的通透性，实现逐步释放内容物的目的。

(3)ε-聚赖氨酸在高吸水性树脂中的应用

目前国内外吸水性树脂主要是聚丙烯酸，它在环境中难以降解，对土壤等环境造成严重污染，加上其以石油加工衍生物为原料，在资源日益缺乏的今天将面临短缺的问题。近年来，寻找可生物降解吸水性材料已经成为热点，交联的聚谷氨酸和PL都是理想的替代品。

2．本课题主要研究内容和预期目标

2.1主要研究内容：

本研究立足于国内外研究现状，以工业甘油和木薯淀粉为原料来做为碳源，以白色链霉菌为生产菌，通过单因素和响应面分析方法来优化发酵培养基，从而最大限度的发挥突变菌株代谢生产ε-PL的特性，提高ε-PL的产量。具体研究内容如下：

1）利用摇瓶单因素实验，考察工业甘油浓度对白色链霉菌生长和发酵生产ε-PL的影响。

2）将木薯淀粉配制成不同浓度，利用单因素实验考察其对白色链霉菌的生长和发酵生产ε-PL的影响。

3）根据单一碳源实验的结果，考虑将工业甘油和木薯淀粉这两种碳源进行复配，来研究混合碳源对白色链霉菌的生长和发酵生产ε-PL的影响，优化两种碳源在发酵培养基中的比例。

4）发酵培养基中重要因素的筛选。利用PB法对发酵过程的9个因素进行设计，其中因素水平根据单因素实验的结果进行确定。

5）采用最陡爬坡试验设计对响应区域进行优化，从而确定最佳的响应区域。

6）利用响应面分析法对这些筛选出来的重要因子进行参数寻优。

7）研究白色链霉菌发酵72h后的菌体浓度、甘油含量、葡萄糖含量、ε-PL的产量等指标，与优化前的产量进行对比。

8）利用5L发酵罐进行调控，对优化后的发酵培养基进行放大实验，从而最大限度的提高ε-PL的产量。

本实验可能需要的实验仪器有：摇床、台式离心机、超净工作台、恒温培养箱、电磁炉、分析天平、铁架台、4℃电冰箱、5L发酵罐等等。

2.2预期目标：

期望通过单因素和响应面分析方法来优化发酵培养基，确定工业甘油和木薯淀粉最合适的复配比例，从而最大限度的发挥白色链霉菌代谢生产ε-PL的特性，提高ε-PL的产量，为实现工业化生产ε-PL提供一定的帮助。

3．本课题拟采用的研究方法、步骤

3.1主要研究方法：摇瓶发酵。

3.2发酵工艺流程：菌种母斜面→菌种子斜面→液体种子→摇瓶种子→发酵生产→离心分离菌体，收集上清→进行参数分析。

3.3研究技术路线：根据2.1的总体思路，本研究提出图1-4所示的研究技术路线。通过单因素和响应面分析方法来优化发酵培养基，确定工业甘油和木薯淀粉最合适的复配比例，从而最大限度的发挥白色链霉菌代谢生产ε-PL的特性，提高ε-PL的产量

3.4实验方法：

（1）菌种母斜面：这是老师直接购买和紫外诱变得到的菌株，并于4℃冰箱保存。

（2）菌种子斜面：基本培养基，划线接种,扩大培养菌种，完成菌种活化过程。

（3）液体种子培养：每50ml种子培养基接1ml菌悬液，并在摇床中培养24h。

（4）摇瓶发酵：液体种子按10%的接种量接于发酵培养基中（根据情况配制），在摇床中培养72h。

（5）分析方法：总糖含量（苯酚-浓硫酸法）、还原糖含量（DNS法）、氨基氮含量（甲醛滴定法）、菌体提取（离心法）、菌体浓度(湿菌体法)、ε-PL含量（甲基橙法）。

实验主要涉及到ε-PL的分析方法。糖含量的分析方法，目前主要采用斐林试剂滴定法、还原糖测定仪、3，5-二硝基水杨酸法等测定总糖含量和还原糖含量。ε-PL含量的分析方法，目前使用最为广泛的为甲基橙法。实验具体方法可因实验情况而定。

为了使实验数据尽可能的准确，实验数据每个水平均设有两到三个平行组取其平均值，多个水平进行。

（6）整理数据，挑出产生ε-PL含量最高的菌，获得高产菌株，并得到最佳培养基。

4．本课题主要参考文献

[1]MasanobuNishikawa，KenichiOgawa.DistributionofMicrobesProducingAntimicrobialε-Poly-L-LysinePolymersinSoilMicrofloraDeterminedByaNovelMethod.AppliedandEnvironmentalMicrobiology，2002，68（7）：3575-3581.

[2]朱宏阳，徐虹，吴群，等.ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定.微生物学通报，2005，32（5）：127-130.

[3]诸葛键，李华钟．微生物学[M]．北京：科学出版社，2004，333

[4]Shimas，SakaiH．PolylysineproducedbyStreptomyces[J].Ac．Bio1．Chem．，1977，41(9)：18071809．

[5]ShimaS，SakaiH．PolyLlysineproducedbyStreptomycespartIItaxonomyandfermentationstudies[J]．Agric．Bio1．Chem．，1981，45(11)：24972502．

[6]姜珊，刘梅，王宝杰，等．大肠杆菌表达抗脂多糖因子的发酵条件优化[J]．中国农业科技导报，2011,13(4)：128134．

[7]LiS，TangL，ChenXS，eta1．．IsolationandcharacterizationofanovelpolyLlysineproducingstrain：StreptomycesgnseofuscHs[J]．IndMicrobio1Biotechno1，2011，38(4)：577563．

[8]hzhakiR．Colorimetricmethodforestimatingpolylysineandpoly-arginine[J]．Ana1．Biochem．，1972，50：569574．

[9]PlackettRL，BurmanJP．Thedesignofoptimummultifactorialexperiment[J]．Biometrika，1946，33(4)：305325．

[10]XuCP，KimSW，HwangHJ，eta1．．ApplicationofstatisticallybasedexperimentaldesignsfortheoptimizationofexopolysaccharideproductionbyCordycepsmilitarisNG3[J]．BiotechApp1Biochem，2002，36(2)：127131．

[11]庞倩婵，纪凯华，王燕森，等．响应面法优化Paenibacillussp．JX426产黄原胶降解酶发酵培养基[J]．中国酿造，2011(2)：3337．

[12]ChenXS，TangL，LiS．OptimizationofmediumforenhancementofsPolyL-LysineproductionbyStreptomycessp．MZ18withglycerolascarbonsource[J].BioresourTechno1，2010，102：17271732．

[13]KobayashiK，NishikawaM．Promotionof￡一polyL-lysineproductionbyironinKitasatosporaKifunense[J]．WorldJMicrobio1Biotech，2007，23：10331036．

[14]WangGL，JiaSR，WangT，eta1．．EfectofferrousiononePolyLLysinebiosynthesisbyStreptomycesdiastatochromogenesCGMCC3145[J]．CurtMicrobio1，2011，62：10621067．

[15]杨玉红，刘芳，康宗利，等．响应面法分析优化StreptomycesalbusB-215菌发酵产8一聚赖氨酸培养基[J]．中国酿造，2011，11(4)：138142．

[16]BankarSB，SinghalRS．OptimizationofpolylysineproductionbyStreptomycesnourseiNRRL5126[J]．BioresourTechno1，2010，101：83708375．

[17]ChenXS,MaoZG.ComparisonofGlucoseandGlycerolasCarbonSourcesforε-Poly-l-LysineProductionbyStreptomycessp.M-Z18[J].AppliedBiochemistryBiotechnology,2013.DOI10.1007/s12010-013-0167-5.

[18]储炬,李友荣.现代生物工艺学(上册)[M].上海:华东理工大学出版社.2007,123.

[19]蔡谨,孙章辉,王隽等.补料发酵工艺的应用及其研究进展[J].工业微生物,2005,35(1):42-48.

[21]PlackettRL,BurmanJP.Thedesignofoptimummultifatorialexperiments[J].Biometrika,1946(37):305~325.

[22]史应武,娄恺,李春.E-聚赖氨酸的生物合成与降解及其应用研究进展[J].中国农业科学,2009,42(3):1009~1015.

[23]曹伟峰，谭之磊，袁国栋，贾士儒.ε-聚赖氨酸测定方法的改进[J]天津科技大学学报.

[24]KushwahaDR,MathurKB,BalasubramanianD.Poly(ε-L-lysine):synthesisandconformation[J].Biopolymers,1980,19:219-229.

[25]张东荣，王正刚，毛忠贵.ε-聚赖氨酸的研究进展[J].氨基酸和生物资源,2005,27(2):48-51.

[26]谢建飞，杨玉红，陈红漫，等.防腐型乳化剂葡聚赖氨酸的研究[J].食品科学，2009,30(11):131-133.

4．本课题的具体进度安排（包括序号、起迄日期、工作内容）

1）2022-03-04～2022-03-10：查阅资料撰写开题报告；

2）2022-03-11～2022-03-16：斜面培养基制备与菌种的活化；

3）2022-03-17～2022-03-22：单因素实验确定工业甘油浓度及木薯淀粉浓度；

4）2022-03-23～2022-04-01：工业甘油和木薯淀粉这两种碳源复配浓度的确定实验；

5）2022-04-02～2022-04-10：发酵培养基中关键因子的筛选实验；

6）2022-04-11～2022-04-17：确定最佳响应区域的实验；

7）2022-04-18～2022-05-01：培养基的响应面实验；

8）2022-05-02～2022-05-19：发酵罐中培养基的验证和放大实验；

9）2022-05-20～2022-05-28：补充实验，整理试验数据和结果，撰写论文；

10）2022-05-28～：修改补充论文，准备答辩。