1. 研究目的与意义
随着经济的高速发展,人类对煤、石油等化石燃料的需求日益增加,化石燃料在燃烧过程中释放的so2、nox等废气严重影响了大气的环境质量。我国许多城市和地区普遍出现酸雨现象,苏州是江苏酸雨发生频次和程度最严重的地区。酸雨对植物的危害表现在直接影响和间接影响.直接影响是直接作用于植物全身;间接影响体现在土壤酸化后结构、营养成分、通气等的劣化。
针对我国苏南地区酸雨频繁,结合稀土元素能提高作物抗逆性,研究酸雨胁迫下稀土元素对水稻某些理化性质的影响,以探索减轻或消除酸雨对作物的影响,提供切实可行的农业防护措施,并为这种措施提供理论依据和时间经验。
大量研究资料表明,酸雨可影响植物生长的全过程,改变各种代谢酶活性,特别是对细胞的保护酶系统影响大。一定浓度的稀土元素溶液对作物叶面喷施、浸种、根施不仅有增产效果,而且还有提高抗逆性的作用。稀土微肥作为含有复合稀土的一种农用肥料,正在被用作提高作物抗逆性和增产。
2. 研究内容和预期目标
本课题研究对象的研究对象为苏香梗3号,利用不同种类的稀土微肥对生长到一定阶段(40天左右)的材料进行叶面喷施,研究稀土元素对水稻的某些生理生态特征的生物效应及影响,主要测量指标有:过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧物歧化酶、氧自由基产生速率、硝酸还原酶、丙二醛含量、质膜透性、叶绿素含量八个指标。
针对我国苏南地区酸雨频繁,结合稀土元素能提高作物抗逆性,研究酸雨胁迫下稀土元素对水稻某些理化性质的影响,以探索减轻或消除酸雨对作物的影响,提供切实可行的农业防护措施,并为这种措施提供理论依据和时间经验。
3. 研究的方法与步骤
一.过氧化物酶活性的测定
1.粗酶液的提取
称取苏香梗3号叶片1g,加5ml20mmol/LKH2PO4,于研钵中研磨成匀浆,以4000r/min,收集上清液保存在冷处,残渣再用5mlKH2PO4溶液提取一次,合并两次上清液。
2.酶活性的测定
取光径1cm比色杯2只,于1只中加入反应混合液3ml,KH2PO41ml,作为校零对照,另1只中加入反应混合液3ml,上述酶液1ml(如酶活性过高可适当稀释),立即开启秒表计时,与分光光度计470nm波长下测量OD值,每隔1min读数一次,以每分钟OD变化值表示酶活性大小,即以ΔA470/[ming(鲜重)]表示。蛋白质含量测定按Folin法进行。
二.过氧化氢酶法
(1)酶液提取
同滴定法
(2)测定
取10ml试管3支,其中1支为对照管,2支为处理管
三.超氧化物歧化酶法
1.制备提取液
取苏香梗3号叶片,每克鲜重各加入10ml提取液研磨。13000r/min冷冻离心20min,收集上清液,加入硫酸铵并收集30%-50%饱和度的沉淀。小体积蒸馏水复溶,透析去盐,为超氧化物歧化酶粗酶液。
2.自氧化率测定
在一系列20ml试管中各加9mlTris-Hcl缓冲液工作液,于25℃水浴20min,精确加入40l于25℃预热的邻苯三酚溶液,立即混匀,于25℃准确保温3min。加入50l维生素C溶液,以终止邻苯三酚自氧化反应,倒入1cm光径比色杯。以9mlTris-Hcl缓冲液工作液作空白溶液,于1h内读取420nm处OD值(Ao)。
3.酶活性测定
在Tris-Hcl缓冲液工作液中预先加入一定量待测SOD稀释液,用上述方法测定样品420nm处OD值(As),但注意不加自氧化终止剂微生物C。
抑制率=(AO-AS)/AO100%
SOD单位活力=[(AO-AS)/(AO0.5)]N/V
式中:V为加样体积;
N为样品稀释倍数;
0.5即抑制自氧化反应50%
四.氧自由基产生速率
1.制作标准曲线
亚硝酸根标准曲线的制作:用100mol/LNaNO2(7mg/L)母液配置0.5、10、15、20、25、30mol/LNaNO2各2ml,分别加入2ml对氨基苯磺酸和2mlɑ-萘胺,于25℃中保温20min,然后测定OD530,以[NO2-]和测得的OD530值互为函数作图,值得亚硝酸根标准曲线。
2.植物提取液的制备
取苏香梗3号植物组织2g,加50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8)2ml,充分研磨,10000r/min离心20min,上清液定容至3ml,此液即为O2-产生待测液。
3.O2-产生速率的测定
0.5ml样品提取液中加入0.5ml50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8),1.5ml的1mmol/L盐酸羟胺,摇匀,于25℃中保温1h,然后再加入2ml17mmol/L对氨基苯磺酸和2ml7mmol/Lɑ-萘胺,混合,于25℃中保温20min,取出以分光光度计测定波长530nm的OD值。
4.结果计算
根据实验中的反应式计算出不同处理的植物组织中O2-产生速率,即
O2-产生速率[mol/(minmg鲜重)]=(cVtN)2/(mt)
式中:c为标准曲线上查得的样品中NO2-浓度,单位是mol/L;
N为样品提取液稀释倍数,即4;
Vt为样品提取液总体积,单位是L,即310-3L;
2为NO2-的物质的量是NO2-的2倍;
M为植物组织鲜重,单位是g;
T为反应时间,即60min。
五.硝酸还原酶活性的测定----活体法
1.新鲜取回的叶片(苏香粳3号)水洗,用吸水纸吸干,然后用钻孔气钻成直径约1cm的圆片,用蒸馏水洗涤2-3次,吸干水分,然后于天平上称取等重的叶子圆片两份,每份0.3-0.4g(或每份取50个圆片),分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中:(1)0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液5mL 蒸馏水5mL;(2)0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液5mL 0.2mol/LKNO35mL。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中,接上真空泵抽气,放气后圆片即沉入溶液中。将三角烧瓶置于30℃温箱中,避光保温作用30min,然后分别吸取反应液1mL,以测定NO2-含量。
注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用,以累积糖类,如果组织中糖类含量低,会使酶活力降低,此时则可在反应溶液中加入30g3-磷酸甘油醛或1,6-二磷酸果糖,能显著增加NO2-的产生。
2.NO2-含量的测定
保温30min结束后,吸取反应液1mL于一试管中,加入磺胺试剂2mL,混合摇匀后再加入ɑ-萘胺试剂2mL,再次混合摇匀,静置30min,用分光光度计(520nm)进行测定,记下OD值,从标准曲线上读出NO2-含量,再计算酶活力,以每小时每克鲜重产生的NO2-(g或mol)表示。
3.标准曲线的制作
测定NO2-的磺胺比色法很灵敏,可检出低于1g/mL的NaNO2含量,可于0-5g/mL范围内绘制标准曲线。由于显色反应的速度与重氮反应及偶联作用有关,温度、pH都影响显色速度,同时也影响灵敏度,但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行,则显色速度相同,彼此可以比较。
吸取不同质量浓度的NaNO2溶液(0.5、1、2、4、5g/mL)1mL于试管中,加入磺胺试剂2mL及ɑ-萘胺试剂2mL,混合摇匀,静置30min(或于一定温度水浴保温30min),立即于分光光度计(520nm)比色。以OD值为纵坐标,NaNO2质量浓度为横坐标,绘制OD-质量浓度曲线。
六.丙二醛的测定
1.MDA的提取盆栽小麦在抽穗期停止浇水,进行干旱处理,取叶片1g将其剪碎,加入10%三氯乙酸(TCA)2ml和少量石英砂,研磨;进一步加入8mlTCA充分研磨,匀浆液以4000g离心10min,上清液即为样品提取液。2.显色反应及测定吸取2ml提取液,加入2ml0.6%TBA液,混匀,在试管上加盖塞,置于沸水浴中煮15min,迅速冷却,离心。取上清液测定532nm和450nm处的OD值。对照管以2ml水代替提取液。3.计算MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532nm,TBA与可溶性糖(以蔗糖为例)的反应产物的最大吸收峰在450nm,吸收曲线彼此又有重叠。
七.质膜透性
选取叶龄相似的植物叶片(苏香梗3号),剪下后用湿布包住。实验时用自来水将供试叶片冲洗,除去表面沾污物,再用蒸馏水冲洗1~2次,再用去离子水清洗1-2次,用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分,然后剪成约1cm的小叶片(或用直径为1的打孔器钻取小园片),注意除掉大叶脉。将剪下的小叶片混合均匀,快速称取鲜样三份,每份1g,分别放入编号为A、B、C的三个烧杯中。作如下处理:
A杯放入冰箱0℃以下作低温处理,处理15~30min后取出(供试叶片也可以在实验前低温处理好待用,处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定),加入去离子水50ml。B杯常温处理,加入去离子水50ml。
将A、B二杯放入真空干燥器,用真空泵抽气2030min(以抽出细胞间隙中的空气),然后缓缓放入空气,从真空干燥器中取出A、B杯。
C杯加入蒸去离子水50ml,称重,盖上表皿,置于电炉上煮沸10~15min(煮沸时间依不同植物叶片而定),冷却后再称重并加去离子水至原重量,继续浸泡叶片。
将A、B、C三杯放置室温下浸提1h左右(经常摇动,以有利电解质外渗)。然后将叶片从杯中夹出进行下一步测定。
3.电导率测定
用电导仪分别测定A、B、C三杯的电导率,同时测定去离子水(空白)的电导率(注意:每测定完一个样液后,用去离子水漂洗电极,再用滤纸将电极擦干,然后进行下一个样液的测定),所测得的结果记入下表:
处理 | 电导率(μScmˉ1) | 电解质的相对外渗率 |
去离子水(空白) | ||
A(低温) | ||
B(常温) | ||
C(煮沸) |
结果计算:
按下列公式计算低温及常温处理的电解质的相对外渗率:
处理电导率空白电导率
电解质的相对外渗率(%)=100%
煮沸电导率空白电导率
八.叶绿素含量
用叶绿素仪测定叶片的叶绿素含量。
4. 参考文献
[1]张美萍,陕永杰,江玉珍,等.稀土微肥对盐胁迫下黄豆幼苗抗氧化酶的影响[j].稀土,2009,30(3):5356.
[2]金琎,曹玲,王洁敏,等.la的不同使用方法对酸雨胁迫下小麦保护酶系统的影响[j].江苏农业科学.2010(3):95-96.
[3]仲小敏,张亚丽,周青.la(Ⅲ)对酸雨胁迫下水稻种子萌发能量代谢影[j]2009:59-62.
5. 计划与进度安排
1、2022年12月6日-2022年1月10日按照指导教师要求,查阅相关文献;
2、2022年2月16日-2022日2月28日与指导老师见面,汇报所查阅文章概况;接受任务;
3、2022年3月1日-2022日3月21日根据任务书撰写开题报告;进行预实验,熟悉相关实验方法;以上工作在课余完成。
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