几种稀土微肥对酸雨胁迫下水稻防护作用的比较开题报告

1. 研究目的与意义

随着经济的高速发展，人类对煤、石油等化石燃料的需求日益增加，化石燃料在燃烧过程中释放的so2、nox等废气严重影响了大气的环境质量。我国许多城市和地区普遍出现酸雨现象，苏州是江苏酸雨发生频次和程度最严重的地区。酸雨对植物的危害表现在直接影响和间接影响.直接影响是直接作用于植物全身;间接影响体现在土壤酸化后结构、营养成分、通气等的劣化。

针对我国苏南地区酸雨频繁，结合稀土元素能提高作物抗逆性，研究酸雨胁迫下稀土元素对水稻某些理化性质的影响，以探索减轻或消除酸雨对作物的影响，提供切实可行的农业防护措施，并为这种措施提供理论依据和时间经验。

大量研究资料表明,酸雨可影响植物生长的全过程，改变各种代谢酶活性，特别是对细胞的保护酶系统影响大。一定浓度的稀土元素溶液对作物叶面喷施、浸种、根施不仅有增产效果,而且还有提高抗逆性的作用。稀土微肥作为含有复合稀土的一种农用肥料，正在被用作提高作物抗逆性和增产。

2. 研究内容和预期目标

本课题研究对象的研究对象为苏香梗3号，利用不同种类的稀土微肥对生长到一定阶段（40天左右）的材料进行叶面喷施，研究稀土元素对水稻的某些生理生态特征的生物效应及影响，主要测量指标有：过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧物歧化酶、氧自由基产生速率、硝酸还原酶、丙二醛含量、质膜透性、叶绿素含量八个指标。

针对我国苏南地区酸雨频繁，结合稀土元素能提高作物抗逆性，研究酸雨胁迫下稀土元素对水稻某些理化性质的影响，以探索减轻或消除酸雨对作物的影响，提供切实可行的农业防护措施，并为这种措施提供理论依据和时间经验。

3. 研究的方法与步骤

一．过氧化物酶活性的测定

1.粗酶液的提取

称取苏香梗3号叶片1g，加5ml20mmol/LKH2PO4，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min,收集上清液保存在冷处，残渣再用5mlKH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液。

2.酶活性的测定

取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3ml，KH2PO41ml，作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可适当稀释），立即开启秒表计时，与分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次，以每分钟OD变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[ming（鲜重）]表示。蛋白质含量测定按Folin法进行。

二．过氧化氢酶法

(1)酶液提取

同滴定法

（2）测定

取10ml试管3支，其中1支为对照管，2支为处理管

三．超氧化物歧化酶法

1.制备提取液

取苏香梗3号叶片，每克鲜重各加入10ml提取液研磨。13000r/min冷冻离心20min，收集上清液，加入硫酸铵并收集30%-50%饱和度的沉淀。小体积蒸馏水复溶，透析去盐，为超氧化物歧化酶粗酶液。

2.自氧化率测定

在一系列20ml试管中各加9mlTris-Hcl缓冲液工作液，于25℃水浴20min，精确加入40l于25℃预热的邻苯三酚溶液，立即混匀，于25℃准确保温3min。加入50l维生素C溶液，以终止邻苯三酚自氧化反应，倒入1cm光径比色杯。以9mlTris-Hcl缓冲液工作液作空白溶液，于1h内读取420nm处OD值（Ao）。

3.酶活性测定

在Tris-Hcl缓冲液工作液中预先加入一定量待测SOD稀释液，用上述方法测定样品420nm处OD值（As），但注意不加自氧化终止剂微生物C。

抑制率=（AO-AS）/AO100%

SOD单位活力=[（AO-AS)/(AO0.5)]N/V

式中：V为加样体积；

N为样品稀释倍数；

0.5即抑制自氧化反应50%

四．氧自由基产生速率

1.制作标准曲线

亚硝酸根标准曲线的制作：用100mol/LNaNO2(7mg/L)母液配置0.5、10、15、20、25、30mol/LNaNO2各2ml，分别加入2ml对氨基苯磺酸和2mlɑ-萘胺，于25℃中保温20min，然后测定OD530，以[NO2-]和测得的OD530值互为函数作图，值得亚硝酸根标准曲线。

2.植物提取液的制备

取苏香梗3号植物组织2g，加50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）2ml，充分研磨，10000r/min离心20min，上清液定容至3ml，此液即为O2-产生待测液。

3.O2-产生速率的测定

0.5ml样品提取液中加入0.5ml50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8），1.5ml的1mmol/L盐酸羟胺，摇匀，于25℃中保温1h，然后再加入2ml17mmol/L对氨基苯磺酸和2ml7mmol/Lɑ-萘胺，混合，于25℃中保温20min，取出以分光光度计测定波长530nm的OD值。

4.结果计算

根据实验中的反应式计算出不同处理的植物组织中O2-产生速率，即

O2-产生速率[mol/(minmg鲜重)]=（cVtN）2/(mt)

式中：c为标准曲线上查得的样品中NO2-浓度，单位是mol/L;

N为样品提取液稀释倍数，即4；

Vt为样品提取液总体积，单位是L，即310-3L;

2为NO2-的物质的量是NO2-的2倍；

M为植物组织鲜重，单位是g；

T为反应时间，即60min。

五．硝酸还原酶活性的测定----活体法

1.新鲜取回的叶片（苏香粳3号）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔气钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2-3次，吸干水分，然后于天平上称取等重的叶子圆片两份，每份0.3-0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：（1）0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液5mL 蒸馏水5mL；（2）0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液5mL 0.2mol/LKNO35mL。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后圆片即沉入溶液中。将三角烧瓶置于30℃温箱中，避光保温作用30min，然后分别吸取反应液1mL,以测定NO2-含量。

注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以累积糖类，如果组织中糖类含量低，会使酶活力降低，此时则可在反应溶液中加入30g3-磷酸甘油醛或1,6-二磷酸果糖，能显著增加NO2-的产生。

2.NO2-含量的测定

保温30min结束后，吸取反应液1mL于一试管中，加入磺胺试剂2mL，混合摇匀后再加入ɑ-萘胺试剂2mL，再次混合摇匀，静置30min，用分光光度计（520nm）进行测定，记下OD值，从标准曲线上读出NO2-含量，再计算酶活力，以每小时每克鲜重产生的NO2-（g或mol)表示。

3.标准曲线的制作

测定NO2-的磺胺比色法很灵敏，可检出低于1g/mL的NaNO2含量，可于0-5g/mL范围内绘制标准曲线。由于显色反应的速度与重氮反应及偶联作用有关，温度、pH都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。

吸取不同质量浓度的NaNO2溶液（0.5、1、2、4、5g/mL）1mL于试管中，加入磺胺试剂2mL及ɑ-萘胺试剂2mL，混合摇匀，静置30min（或于一定温度水浴保温30min），立即于分光光度计（520nm）比色。以OD值为纵坐标，NaNO2质量浓度为横坐标，绘制OD-质量浓度曲线。

六．丙二醛的测定

1.MDA的提取盆栽小麦在抽穗期停止浇水，进行干旱处理，取叶片1g将其剪碎，加入10%三氯乙酸（TCA）2ml和少量石英砂，研磨；进一步加入8mlTCA充分研磨，匀浆液以4000g离心10min，上清液即为样品提取液。2.显色反应及测定吸取2ml提取液，加入2ml0.6%TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm处的OD值。对照管以2ml水代替提取液。3.计算MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532nm，TBA与可溶性糖（以蔗糖为例）的反应产物的最大吸收峰在450nm，吸收曲线彼此又有重叠。

七．质膜透性

选取叶龄相似的植物叶片(苏香梗3号)，剪下后用湿布包住。实验时用自来水将供试叶片冲洗，除去表面沾污物，再用蒸馏水冲洗1～2次，再用去离子水清洗1-2次，用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分，然后剪成约1cm的小叶片（或用直径为1的打孔器钻取小园片），注意除掉大叶脉。将剪下的小叶片混合均匀，快速称取鲜样三份，每份1g，分别放入编号为A、B、C的三个烧杯中。作如下处理：

A杯放入冰箱0℃以下作低温处理，处理15～30min后取出（供试叶片也可以在实验前低温处理好待用，处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定），加入去离子水50ml。B杯常温处理，加入去离子水50ml。

将A、B二杯放入真空干燥器，用真空泵抽气2030min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出A、B杯。

C杯加入蒸去离子水50ml，称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸10～15min（煮沸时间依不同植物叶片而定），冷却后再称重并加去离子水至原重量，继续浸泡叶片。

将A、B、C三杯放置室温下浸提1h左右（经常摇动，以有利电解质外渗）。然后将叶片从杯中夹出进行下一步测定。

3.电导率测定

用电导仪分别测定A、B、C三杯的电导率，同时测定去离子水（空白）的电导率（注意：每测定完一个样液后，用去离子水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测定），所测得的结果记入下表：

结果计算：

按下列公式计算低温及常温处理的电解质的相对外渗率：

处理电导率空白电导率

电解质的相对外渗率（%）=100%

煮沸电导率空白电导率

八．叶绿素含量

用叶绿素仪测定叶片的叶绿素含量。

4. 参考文献

[1]张美萍,陕永杰，江玉珍，等.稀土微肥对盐胁迫下黄豆幼苗抗氧化酶的影响[j].稀土，2009,30(3):5356.

[2]金琎，曹玲，王洁敏，等.la的不同使用方法对酸雨胁迫下小麦保护酶系统的影响[j].江苏农业科学.2010（3）:95-96.

[3]仲小敏,张亚丽,周青.la(Ⅲ)对酸雨胁迫下水稻种子萌发能量代谢影[j]2009:59-62.

5. 计划与进度安排

1、2022年12月6日-2022年1月10日按照指导教师要求，查阅相关文献；

2、2022年2月16日-2022日2月28日与指导老师见面，汇报所查阅文章概况；接受任务；

3、2022年3月1日-2022日3月21日根据任务书撰写开题报告；进行预实验，熟悉相关实验方法；以上工作在课余完成。