UN2基因决定绿豆复叶发育的遗传调控网络研究开题报告

全文总字数：9169字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、课题的意义复叶在不同的植物类群中经历了多次独立的进化，形成了各异的形态和不同的发育模式。

class i knotted-like homeobox (knoxi)基因和植物复叶发育密切相关，但在豆科inverted repeat-lacking clade (irlc)分支的植物中（如豌豆、蒺藜苜蓿），leafy (lfy)基因取代了knoxi基因的功能来调控复叶发育。

传统观点认为在non-irlc豆科植物中，其复叶发育受knoxi基因的控制，而lfy基因的作用甚微。

2. 研究的基本内容和问题

1） 研究目标：un2基因在绿豆复叶发育中的功能及基因定位。

2） 研究内容：本课题以绿豆叶片为材料，在绿豆不同生长期对其叶片发育情况进行观察记录。

同时在不同生长期进行去顶处理，研究去顶和不去顶情况下对绿豆叶片发育的影响。

3. 研究的方法与方案

一、 引物设计例：

	Sequence (5-3)	Template str	Length	Start	Stop	Tm	GC	Self complementarity
Fward primer	GTCACTCCCAACAACACACTT	Plus	21	102	122	58.63	47.62	3.00
Reverse primer	CAAGTGCATCATTTTTAGGAACA	Minus	23	282	260	56.00	34.78	4.00

二、提取DNA1.取植物新鲜组织约100 mg,加入液氮充分碾磨。2.将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65 ℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇,使其终浓度为0.1 ),迅速颠倒混匀后,将离心管放在65℃水浴20 min,水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。3.加入700μL氯仿,充分混匀,12,000 rpm离心5 min。注若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿们/11进行等体积抽提。4.小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中,加入700 μL缓冲液GP2,充分混匀。5.将混匀的液体转入吸附柱CB3中,12,000 rpm离心30sec，弃掉废液，(吸附柱容积为700 μL左右,可分次加入离心。)6.向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD,12000 rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。7.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW,12,000 rpm离心30 sec,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。8.重复操作步骤7。9.将吸附柱CB3放回收集管中,12,000 rpm离心2 min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μL洗脱缓冲液TE,室温放置2-5 min,12,000 rpm离心2 min,将溶液收集到离心管中。三、DNA聚合酶式反应（PCR）反应体系为：试剂 用量Template10xTaq酶 buffer 1 μL2 μL2.5 mM dNTP 2 μL10 uM Primer 0.4 μL5 U/μL TaqDNA ploymerase 0.2 μLddH2O 加至20 μL 反应条件：1、94 ℃变性3 min；2、94 ℃变性30sec；3、退火30 sec；4、72 ℃延伸，延伸5 min；取3-5 μL扩增产物用琼脂糖电泳进行检测鉴定。。四、分子标记选择与开发通过序列对比分析挖掘InDel标记，，利用分子标记设计引物进行PCR扩增，再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性是否可用。五、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)1.实验开始前先将玻璃板洗干净,晾干后装进皮套备用。2按每块胶10m2xTBE溶液的量配制1Agrose封底胶。称取适量的 Agrose配制1Agrose封底胶,倾斜倒入装好的玻璃板内,注满底部即可。3.约20 min后,封底胶凝固,配制聚丙烯酰胺凝胶即变性胶按每块胶25 mL 聚丙烯酰胺母液/20 μL TEMED/0.4 mL 10 过硫酸铵(AP)溶液的比例配胶，迅速混匀后立刻注胶,并插上小孔梳子,静置待凝固后使用。4.水平放置约2 h,待变性胶完全凝固后,拔岀梳子,将电泳板装入电泳槽,四角旋紧,加入电泳液(注意检査电泳槽是否漏水,如果漏水严重需要重新安装)。5.在确保电泳槽的不漏水后,用枪头反复吹打清洁泳道,以保证样品能沉到泳道底部。然后用注射式加样器按顺序点样。6.样品加入完成,启动电泳仪,将电压控制在200 V左右。电泳约2个小时后银染。六、银染1.关闭电源,拔掉接线,将缓冲液倒入缓冲液收集箱。拆卸电泳槽,取岀 PAGE胶,放入盛有单蒸水的盆中漂洗2 min左右。2.按0.1 称AgNO3溶于水中,放入PAGE胶染色10 min。然后取出,再次放入单蒸水中漂洗2 min。3.将PAGE胶浸泡在NaOH显色液中,显色1O min以上(根据具体情况,背景颜色不能过深,否则影响观察)。4待条带清晰显现后,将胶移入清水中固定(最好是用白色的瓷盘,便于观察)。观察拍照并记录结果。丙烯酰胺母液配制(1)10×TBE的配制Tris碱 108 g硼酸(H3BO3) 55 gEDTA一Na2H2O 7.44 gddH2O up to 1000 mL(2)4L丙烯酰胺母液配制丙烯酰胺 250 gN,N′一亚甲双丙烯酰胺 13.0 g尿素 500 g10×TBE 400 mLddH2O up to 4000 mL10 过硫酸胺溶液配制过硫酸胺 10.0 gddH20 up to 100 mL0.1ANO3溶液的配制通常以4块PAG胶为基准,称取0.4 g的AgNO3,ddH2O 400 mL,当胶块数多于4块时,以每块胶0.1 g AgNO3/100 mL ddH2O的比例增加(AgNO3溶液有毒,需要现配现用)。NaOH显色溶液以4块胶为基准进行配制总体积400 mL的显色液,当胶数大于4块时,以4块胶的梯度增加。NaOH 6 g四硼酸钠 0.076 g甲醛 1.6ddH20 up to 400 mL10 x loadin bufter的配制溴酚蓝 1.7 g二甲苯氰FF 1.7 g蔗糖 266.6 gddH2O up to 400 mL

4. 研究创新点

绿豆作为豆科植物复叶发育的新的模式系统，其分子机制尚不清楚。

un2是实验室新鉴定的绿豆复叶发育突变体，与绿豆基因突变体un1存在遗传相互作用。

定位un2基因，解析其调控复叶的遗传网路，有助于揭示绿豆复叶发育的分子机理。

5. 研究计划与进展

1） 研究周期：2019年2月——2019年5月2） 研究阶段：A. 2019年2月——2019年4月：设计引物、提取绿豆叶片DNA、DNA聚合酶式反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)B. 2019年4月——2019年5月：对不同时期绿豆叶片拍照记录、整理数据并总结3） 预期进展：预计5月初完成全部实验，定位调控复叶发育的基因UN2。