1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 本课题研究意义

霍乱弧菌（vibrio cholerae）是一种革兰氏阴性菌^[1]，是烈性传染病霍乱的病原菌，自1817年以来已经爆发过7次世界性的霍乱大流行，每次爆发都带来了巨大的损失。

最近的一次霍乱爆发是2012年西非国家塞拉利昂和几内亚发生的霍乱大流行，造成上万人被感染，二百多人死亡，本次疫情直至现在仍未得到有效控制。每年有约3至5百万例霍乱病例，约1至2万人死亡。可见霍乱是一种对人类有着严重影响的的烈性传染病，但目前对霍乱仍没有有效的控制方法。

目前关于霍乱弧菌的毒力、免疫以及致病机制等方面的研究很多,具体的致病机理已经得到了阐述，关于霍乱弧菌其致病毒力因子主要为两种：霍乱毒素（cholerae toxin，ct）和毒素共调节菌毛（toxin-coregulated pilus，tcp）。同时霍乱弧菌还具有复杂高效的基因表达调控系统,可以在不同的环境条件下，对包括定殖因子和毒力基因在内的一系列基因进行相应的调控，使各基因的表达在不同条件下被激活或者抑制^[2]。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标

1.1霍乱弧菌中的非编码DNA

在对霍乱弧菌的研究过程中发现，霍乱弧菌基因组上除了具有相应功能的编码序列外，还含有很大一部分不编码蛋白质的间隔序列，占霍乱弧菌总基因组的15%以上，而随着目前国内外的研究发现，间隔序列已不再是无用的垃圾基因，它在基因组中扮演着启动子、增强子、沉默子以及功能性保守元件等多种角色，直接或间接参与基因表达调控、RNA选择性剪接、稳定染色体结构等生命活动 。因此我们推测霍乱弧菌中占有相当大比例的间隔序列也存在着相应的功能。我们在相应网站上查找霍乱弧菌中的间隔序列时发现，霍乱弧菌基因组上存在大量非编码DNA, 其中大小超过1000kb，保守性较强的非编码DNA序列，可能在霍乱弧菌的生理表型及基因表达调控上有许多尚未可知的重要作用，因此我们通过基因框内敲除的方法，构建相应缺失株，从而检测其对霍乱弧菌生长繁殖、及毒力表达的影响。

1.2间隔序列筛选结果

2研究内容

2.1间隔序列的筛选

Junker(http://pranag.physics. iisc .ernet.in/junker/)是用来寻找基因组中间隔序列的专业网站，首先在该网站上筛选出霍乱弧菌中所有大于1000bp的间隔序列，再通过在National Center for Biotechnology Information(NCBI)官网上与其他弧菌类基因组进行同源性比较，筛选出同源性较高且没有开放性阅读框（ORF）或开放性阅读框所占比例较小的间隔序列。目前筛选出了10个可能存在潜在功能的间隔序列。

2.2构建相应的实验菌株

（1）对筛选获得的间隔序列通过双交换敲除的方法，构建实验所需的缺失株。

（2）构建霍乱弧菌主要毒力基因tcpA、tcpP、toxT、toxR的冷光表达菌株：pBBRlux载体上含有缺乏启动子的luxCDABE冷光报告基因簇，该基因簇的表达需要借助外源启动子。首先通过PCR的方式获得基因启动子区域（约500 bp），将其连接到检测质粒pBBRlux上，并通过接合的方式分别转入野生株及各间隔序列的敲除株中。

2.3各间隔序列相关功能的研究

（1）间隔序列突变株的生长测定：将野生型vc6706和各间隔序列的缺失株分别在LB和M9培养基中静置以及振荡培养，比较各菌株的生长情况(生长速度)。

（2）间隔序列对毒力基因表达的调控作用：将含有pBBRlux-tcpA、pBBRlux-tcpP、pBBRlux- toxT、pBBRlux- toxR 的WT及间隔序列缺失株，分别在AKI培养基中静置及震荡条件下培养至一定细胞浓度，比较WT和各间隔序列缺失株中冷光值的差异，判断各间隔序列对tcpA、tcpP、toxT、toxR是否有调控作用。

（3）对H2O2、cumene hydroperoxide等过氧化物的敏感性检测：倒双层板，下层为LB培养基，上层为含有一定浓度WT/间隔序列缺失株的半固体LB培养基，平板中间放入加有相应体积过氧化物的滤纸片，培养一定时间后，通过观察抑菌圈的大小，判断各菌株对过氧化物的敏感性。

（4）生物膜形成能力检测：将各菌株在试管中培养到一定时间后，洗去菌液，用结晶紫染色，比较各菌株的生物膜的厚度与膜中所含菌体的浓度大小，从而判断其成膜能力的大小。

（5）游动性能力检测：通过观察平板上培养至一定时间的各菌株的游动圈大小，判断各菌株的游动性能力。

3拟解决的关键问题

霍乱弧菌基因组上存在大量非编码DNA, 其中大小超过1000kb，保守性较强的非编码DNA序列，可能在霍乱弧菌的生理表型及基因表达调控上有许多尚未可知的重要作用，因此我们此次研究主要目的是通过基因框内敲除的方法，构建相应缺失株，从而检测霍乱弧菌上的非编码DNA的功能，尤其是对霍乱弧菌生长繁殖、及毒力表达的方面的作用。

3. 研究的方法与方案

1研究方法

a)二亲接合；

b)基因敲除；

c)质粒，总dna的提取；

4. 研究创新点

特色或创新之处

特色或创新之处

霍乱弧菌中存在大量的非编码DNA，他们在霍乱弧菌的毒力基因表达方面可能具有潜在的调控作用，其次，目前对于霍乱弧菌中的非编码DNA功能研究国内外很少有涉足，因此目前本实验的研究具有很大的前景。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

研究计划及预期进展

2016年9月～2016年10月：确定课题，与指导老师共同商议定下毕业设计课题，完成该课题相关文献综述

2016年10月~2016年12月：完成开题报告；完成非间隔序列的筛选和相关实验株的构建