高产四氢嘧啶中度嗜盐菌的分离和特性研究开题报告

全文总字数：5427字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

四氢嘧啶类物质是中度嗜盐菌应答环境高渗透压胁迫所合成的渗透压补偿溶质，主要包括四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶。同其他相容性溶质相比，四氢嘧啶作为酶的抗逆（抗热、抗冷冻、抗干燥等）保护剂性能优越；在大肠杆菌长期保存过程中显著地减少了其菌株活力的降低。四氢嘧啶在化妆品、食品、生物制剂和制药等领域具有广泛的应用前景。然而，四氢嘧啶分子结构中含有一个手性碳原子，难以通过化学的方法合成，因此，通过筛选四氢嘧啶合成菌株及其合成条件的研究提高其产率，已成为该领域的研究热点。

文献报道的四氢嘧啶合成菌株有海球菌(marinococcussp. m52)、嗜盐海球菌(marinococcus halophilusdsm 20408^t)、伸长盐单胞菌(halomonas elongatadsm 142^t)、喜海水盐单胞菌(halomonas halmophilaccm 2833)、嗜盐盐单胞菌(halomonas halophilaccm 3662)、色盐杆菌(chromohalobacter salexigensdsm 3043^t)、扩展短杆菌(brevibacterium linensdsm 20425^t)和嗜盐假单胞菌(pseudomonas halophiladsm 3050^t)等。

本课题从盐土中分离筛选获得高产四氢嘧啶且能适应较宽盐浓度范围的中度嗜盐菌株，对其进行形态、生理生化及 16s rrna 鉴定，考察培养条件对四氢嘧啶合成的影响，以期为四氢嘧啶的生物合成积累菌种资源。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：分离、筛选出高产四氢嘧啶并能适应较宽盐浓度范围的分泌型的中度嗜盐菌，研究生物学特性并鉴定其种属，研究培养条件对四氢嘧啶合成的影响，以期为四氢嘧啶的生物合成积累菌种资源。

研究内容（1）分离、鉴定以四氢嘧啶为主要相容性溶质的中度嗜盐菌，筛选出较高产的中度嗜盐菌菌种；（2）优化分离菌株生长及合成四氢嘧啶的条件，获得最适生长条件，提高四氢嘧啶的合成量；（3）模拟细菌泌乳工艺，验证菌株在渗透压冲击下四氢嘧啶的合成与释放，研究通过细菌泌乳工艺制备四氢嘧啶的可行性。

拟解决的关键问题：获得高产四氢嘧啶、具分泌性、高/低渗耐受性强的中度嗜盐菌。

3. 研究的方法与方案

（1）富集：称取2 g盐池底泥土样，加入到装有100 ml 2 g/l含10 nacl的乳酸培养基的250 ml锥形瓶中，置于30 ℃、160 rmp摇床上培养一周。

（2）稀释：取编号为1-7的7支试管，每支试管内含有4.5 ml 0.5无菌盐水。取0.5 ml土壤悬液于编号1的试管中进行稀释，充分摇匀，菌液稀释度为10^-1，再从试管1中取0.5 ml菌液于试管2中，充分摇匀，菌液稀释度为10^-2，依次稀释至10^-7，放置4~6 h。

（3）分离纯化：分别取0.1 ml稀释度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的菌液涂布于含10 nacl的乳酸培养基平板上，取0.1 ml稀释度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液涂布于含0.5 nacl的乳酸培养基平板上，每个稀释度做三组平行，30℃培养1周，从平板上挑取单菌落，进行划线纯化，将生长良好的菌株转接到保存培养基，置于4℃冰箱保存备用。

4. 研究创新点

本课题的创新之处在于获得能够耐受渗透压冲击，且高产四氢嘧啶的中度嗜盐菌菌株，同时模拟细菌泌乳工艺对该菌株进行渗透压冲击测定四氢嘧啶的合成与释放。

5. 研究计划与进展

2018.12 撰写专业文献综述

2019.01 确定选题、撰写开题报告

2019.02 采集样品，富集培养，稀释涂布，分离纯化