半乳糖基月桂酸酯抗菌活性及机理的初探研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

（一）本课题的意义 本实验旨在酶法合成的半乳糖基月桂酸甘油酯的基础上，研究其对食品中常见腐败菌的抗菌活性，揭示温度、ph、离子浓度等环境因素对半乳糖基月桂酸甘油酯抗菌活性的影响, 并进一步从细胞和分子水平上探究半乳糖基月桂酸甘油酯的抗菌活性的构效关系和作用机理，为设计合成新型的半乳糖基月桂酸酯抗菌物质提供思路和理论依据。

（二）国内外研究概况 甘油糖酯具有抑制微生物生长的作用，且其抑菌活性与结构有关。有研究人员从菊科植物的根和茎中分离得到了三种甘油糖酯，经过生物活性检测发现对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌三种菌株具有明显的抑制作用^[1]_。 虽然对甘油糖酯抑菌活性的研究比较少，但是国内外关于糖酯抑菌活性的研究比较多。研究发现，大多数糖酯类物质都具有抑制微生物生长的作用，且不同糖酯对不同微生物的抑制作用也不同。糖酯的抑菌活性与酯化程度密切相关，一般糖单酯的抑菌活性要明显高于糖二酯的抑菌活性^[2]_。国内外有学者^[3]通过实验发现，麦芽糖月桂酸单酯对芽孢杆菌、大肠杆菌和植物乳杆菌具有良好的抑菌活性，而麦芽糖月桂酸二酯则无明显的抑菌效果。以蔗糖为糖基供体生成月桂酸糖酯比果糖有着更好的抑制蜡样芽孢杆菌的活性。麦芽糖月桂酸酯对口腔内微生物有着明显的抑制活性，可以作为新型抑制剂应用于口腔卫生产品中。张辉等^[4]研究发现中链脂肪酸甘油单酯（c8~c12）抑制金黄色葡萄球菌的效果最好。ihkov等^[5]对蔗糖月桂酸单酯、单甘油月桂酸酯和二甘油月桂酸酯抑制黑曲霉的效果进行了研究，发现三种物质对黑曲霉均有抑制活性。 蔗糖酯^[6]对微生物具有较广泛的抑制作用，其中对 g 菌，特别是对形成芽孢的 g 菌具有明显抑制作用。在蔗糖酯的诱导下，枯草杆菌可产生自溶酶，从而出现细胞裂解现象。蔗糖酯也可抑制青霉菌对柑橘的危害而延长柑橘的储藏时间。糖酯的抑菌性与其酯化度密切相关。相对而言，蔗糖月桂酸单酯的抑菌性较二酯或多酯的强。与其类似，6-o-麦芽糖月桂酸单酯可抑制杆菌属和植物乳杆菌的生长，6-o-麦芽糖月桂酸单酯和 6-o-麦芽糖月桂酸单酯可抑制杆菌属和大肠杆菌的生长，而 6,6-o-月桂酸二酯对微生物没有明显的抑制作用。 随着对抑菌物质的不断深入研究，发现的抑菌物质的种类及其作用机制也越来越多。目前普遍认可的抑菌作用机制主要有破坏细胞壁和细胞膜，改变细胞膜的通透性、抑制核酸和蛋白质等多种大分子物质的合成以及抑制细胞代谢等多种理论。1.对细菌细胞壁的作用 细胞壁的主要功能是维持菌体固有的形态，对细胞具有一定的保护作用，是一层具有独特生物学意义的屏障。细菌的细胞壁有协助细胞运动和生长、提高机械强度、保持细胞外形、抑制机械和渗透损伤、介导细胞间的相互作用、防止大分子入侵等生理功能。当菌体的细胞壁的完整性受到破坏时，就会失去渗透屏障的保护作用，引起胞内成分的外泄，进而导致菌体膨胀变形，最终裂解死亡。2.作用于细菌的细胞膜 细菌通过细胞膜的渗透性和选择吸收作用从外界环境中汲取营养物质。当细胞膜渗透性平衡被打破时，就会使胞内的细胞质外泄，并由此导致细菌的各项生理功能不能正常进行。细胞膜的通透性的变化可以观察胞外物质的流入、胞内物质的泄露（核酸、蛋白质、钾离子等）、胞内游离钙浓度的变化等。3． 作用于细胞内的酶系统或功能蛋白质 膜蛋白是一类结构独特的蛋白质,镶嵌于膜脂的这一特性使它处于细胞与外界的交界部位,可介导细胞和外界之间信号的传导,并执行许多基本以及重要的细胞生物学功能,比如构成离子跨膜的通道,构成了呼吸链和转运蛋白等。据估计,膜蛋白约占所有序列编码蛋白的1/3,且在目前开发的药物中,有约70%的药物靶点为膜蛋白。根据蛋白质在生物膜中分布的位置,膜蛋白可分为外周膜蛋白和内在膜蛋白。4． 作用于遗传物质或遗传微粒结构 dna是由脱氧核糖核苷酸通过3'，5'-磷酸二酯键连接而成的直线形或环形多聚体， 无分支结构，具有1，2，3级结构，当dna与外源物质作用后，此3级结构会受到不同程度的改变。dna是抑菌物质对食源性致病菌的作用位点之一，其与dna的作用机制也是近年来的研究热点，它与dna结合的方式有非共价键结合和共价键结合。共价键结合是一种化学键加合的反应；非共价键结合则是不涉及化学键断裂的非共价方式。非共价键结合包含3种结合方式：静电结合、沟槽结合和嵌插结合。静电结合方式不具有选择性，是抑菌物质通过静电作用于dna的磷酸骨架；沟槽结合则与dna的碱基对边缘直接作用，通过范德华力和氢键作用嵌入到大沟、小沟之间，沟槽结合分子通常是特定于腺嘌呤-胸腺嘧啶的丰富序列，这是由于鸟嘌呤-胞嘧啶序列空间位阻较大，疏水性和氢键作用在沟槽结合中起到比较重要的作用；嵌插作用则是小分子物质插入碱基内部，与碱基对发生作用，嵌插作用又分为经典插入和传统插入两种模式。

（三）应用前景 甘油糖酯除具有各种生物活性外，同时还是一种高活性的非离子表面活性剂，来源广泛，种类多样，安全性高，应用领域广阔，广泛应用于食品工业、制药和化妆品等行业^[7]_。甘油糖酯在食品工业领域中应用潜力很大。nair等^[8]人发现辛酸甘油单酯有较好的抑制奶制品中大肠杆菌和单增李斯特菌。甘油糖酯的抑菌作用使其可以作为保鲜杀菌剂应用于食品行业中。在日本，甘油糖酯在罐装食品的防腐应用上被广泛使用。因此研究甘油糖酯的抑菌机理将对食品行业等的发展有着举足轻重的作用。

2. 研究的基本内容和问题

（一）研究的目标 测定半乳糖基月桂酸甘油酯的抗菌活性，明确温度、ph、离子浓度等因素对半乳糖基月桂酸甘油酯抗菌活性的影响，明确其抗菌活性-构效关系，并初步探究半乳糖基月桂酸甘油酯的抗菌机理，为开发一种高效、安全、稳定的新型糖脂类食品防腐保鲜剂奠定理论基础，同时丰富天然食品防腐剂的品种。

（二）研究的内容a. 半乳糖基月桂酸甘油酯抗菌活性的研究采用脂肪酶催化的方法合成半乳糖基月桂酸甘油酯，研究其对食品中常见腐败菌（包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌）的抗菌活性，测定最小抑菌浓度（mic）；b. 半乳糖基月桂酸甘油酯抗菌稳定性的研究在确定半乳糖基月桂酸甘油酯抗菌活性的基础上，研究温度、ph、离子浓度等环境因素对其抗菌活性的影响；c. 半乳糖基月桂酸甘油酯抗菌机理的初步研究研究半乳糖基月桂酸甘油酯对菌体生长曲线、细胞膜通透性、胞内大分子物质泄漏、菌体的微观形态等方面的影响，初步揭示半乳糖基月桂酸甘油酯的抗菌机理。

（三）拟解决的关键问题a. 测定半乳糖基月桂酸甘油酯的抗菌谱，测定最小抑菌浓度；b. 明确温度、ph、离子浓度等环境因素对半乳糖基月桂酸甘油酯抗菌活性的影响及揭示可能的抑菌机理。

3. 研究的方法与方案

a. 以固定化脂肪酶novozyme435为催化剂，以半乳糖基甘油为糖基供体，以月桂酸为酰基供体，合成半乳糖基月桂酸甘油酯，通过tlc、硅胶柱层析、hplc-elsd、ms等方法对半乳糖基月桂酸甘油酯进行分离纯化和鉴定；

b. 以合成的半乳糖基月桂酸甘油酯为抗菌物质，食品常见的大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉、黑曲霉和酿酒酵母为指示菌，采用打孔法测定半乳糖基月桂酸甘油酯的抗菌活性；

4. 研究创新点

虽然国内外对糖酯抑菌活性的报道则比较多，但是关于半乳糖基月桂酸甘油酯抑菌活性的研究比较少。本课题采用酶催化法选择性的合成半乳糖基月桂酸甘油酯，研究半乳糖基月桂酸甘油酯对食品常见腐败菌的抗菌活性、稳定性及作用机理，填补了关于半乳糖基月桂酸甘油酯抗菌活性及机理研究方面的不足，具有显著的创新性。

5. 研究计划与进展

第一阶段：2015年11-12月，阅读文献，了解国内外研究相关动态，撰写文献综述；

第二阶段：2015年12月-2016年1月，设计研究思路，进行实验；

第三阶段：2016年3-4月，进行实验，撰写学位论文初稿；