肉源性单增李斯特菌毒力特性分析开题报告

 2022-01-29 18:45:28

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种重要的食源性人畜共患病原菌，可引起脑膜炎、败血症、流产等疾病。虽然LM引起的食源性疾病发病率不高，死亡率却高达30%。WHO也将其列为20世纪90年代食品四大致病菌之一。单增李斯特菌是一种嗜冷微生物，也是重要的食源性人畜共患病原菌，广泛存在于土壤、植物、污水中，易对肉制品、海产品、牛奶蔬菜等造成污染[1]。该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌，无芽孢，无夹膜[2]，能在低温条件下生长（-1.5℃-45℃生长，-20℃可以存活一年)、耐高盐、耐低pH，可以形成生物膜[3]，对环境的适应能力很强，可以在食品的原料、加工、运输、冷藏过程中交叉污染。由LM引起的食源性疾病在欧美国家[4][5][6]和中国[7]相继爆发。食用了被污染的食品后，健康人群易发生类似流感的症状，胃肠炎；孕妇、老人、婴儿等免疫力低下的人群易出现为脑膜炎、败血症、坏死性肝炎、神经症状及单核细胞增多等[8]，死亡率高达20%-30%[9]。由于不同来源LM的毒力和致病性有所不同，因此对食品中分离得到的单增李斯特菌的毒力分析很有必要。

由于单增李斯特菌广泛的存在于自然界中，可在极端的环境中生长，使它很难在食物链中去除，随意其可在各种食品中造成危害。次从1981年来加拿大41人因食用单增李斯特菌污染的凉拌卷心菜发生食品中毒以来，欧美一些国家曾多次发生单增李斯特菌的食物中毒。我国主要以煮食为主，单增李斯特菌对热比较敏感，煮食可杀灭细菌。欧美国家曾多次因此发生单增李斯特菌引起的食物中毒，食源性单增李斯特菌已经成为一个公共的卫生问题。我国从年开始将食品中单增李斯特氏菌的检测纳入食品安全风险监测网,近年来对单增李斯特氏菌的研究虽多,但大多停留在污染监测上,在分离菌株的致病性及菌株间相关性研究上还不完善,从而限制其溯源及鉴定能力。单增李斯特菌分离株因来源不同,在致病力上表现出巨大的差异,有的菌株致病性强,有的很弱甚至无致病性。因此,准确、快速的鉴别单增李斯特氏菌的致病力对于食品安全风险的评估具有重要意义,其可对该地区单增李斯特氏菌的流行趋势进行预测并做好相对的应对措施,进一步避免食源性疾病的爆发。

单增李斯特菌的主要毒力基因

LM在细胞间的感染过程及其致病过程分为三个阶段：首先LM被吞噬细胞吞噬，在内化素A(InlA)、内化素B(InlB)、P60蛋白等粘附分子的帮助下黏附于细胞上。其次，LM在磷脂酶A(PlcA)、磷脂酶B(PlcB)和溶血素(LLO)的协同作用下裂解吞噬体膜。进入胞质后细菌在LM己糖磷酸盐转运蛋白(Hpt)的作用下摄取养分存活增殖。最后，LM在肌动蛋白聚合蛋白(ActA)的辅助下在细胞内运动，并伸出伪足向邻近的细胞扩散，使细菌在宿主细胞间传播。

1.2.2.1与环境抗逆相关的毒力因子

细菌进入宿主的消化道后，要承受胃酸环境和胆酸盐、非特异性炎性因子和蛋白水解酶的破坏作用。胆酸盐水解酶BSH(Bile salt hydrolase)可以分解已经结合的胆酸盐，保护细菌不会受到胆酸盐的杀伤作用[10]。排除胆汁蛋白bilE (Bile exclusion)可以帮助将胆碱盐排出系统抵抗胆汁[11]。甜菜碱转运子BetL (Betaine transporter)[12]、甘氨酸甜菜碱转运子Gbu(Glycine betaine porter)[13]、肉碱转运子OpuC可以产生渗透物摄取系统，保证单增李斯特菌能够抗逆高渗透压环境。

1.2.2.2与粘附侵袭相关的毒力因子

细菌通过与粘附和侵袭相关的毒力因子，入侵进入细胞。内化素是一类与黏附侵袭相关性很

大的毒力因子，它能够识别宿主细胞上的受体，从而完成细菌对靶细胞的内化入侵[14]。细胞壁水解酶P60介导单增李斯特菌入侵非专职吞噬细胞，为该菌细胞分裂所必需[15]。酰胺酶Ami裂解细胞壁并通过其细胞壁锚定使细菌黏附至靶细胞表面[16]。溶血素LLO 可以溶解细胞吞噬体膜而使LM逃离吞噬体，促进菌体进入胞液，是细菌可以在细胞内生存的重要前提。除此之外，还有纤连蛋白结合蛋白FbpA、自溶素aut等毒力因子都协同参与了细菌的黏附和侵袭。

1.2.2.3细胞内感染相关毒力因子

单增李斯特菌在真核细胞内的感染周期与多个因素相关，比如它在细胞内的生存、增殖能力及在细胞间的扩散能力。在溶血素(LLO)和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶PI-PLC的裂解作用下，LM可以从吞噬小体逃离接着进入细胞质中。在己糖磷酸盐转运蛋白Hpt的作用下，利用细胞质中的营养成分进行增殖[17]。与此同时，借助肌动蛋白聚集因子ActA实现细菌在细胞内和细胞间的扩散，其中磷脂酰肌醇特异性卵磷脂酶PlcB和 LLO介导细胞膜的裂解。细菌被临近的细胞吞噬后，便又开始了新一轮的感染。

1.2.2.4毒力调控因子

转录活化因子prfA调控了第一毒力岛LIPI-1的全部基因和第二毒力岛LIPI-2的绝大部分内化素基因[18]。

应答调控因子VirR是仅次于PrfA的第二大毒力调控因子，调控了12个毒力基因，分别是mprF、dltA、dltB、dltC、dltD、Lmo2114和Lmo2115等，其编码基因缺失后，对小鼠的毒力降低，同时对培养细胞Caco-2的侵袭力也显著降低[19]。

随着冷藏、速冻食品越来越多，对单增李斯特菌的监控也越来越严格。然而有些菌株毒力很强，有些菌株毒力较弱。为了区分不同来源菌株的毒力，可以采用体内毒力实验、体外细胞实验、PCR检测毒力基因、检测毒素和DNA序列分析的方法。因此，本课题采用PCR毒力基因的方法分析不同来源的肉源单增李斯特菌的毒力。

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随

2. 研究的基本内容和问题

该课题主要的研究目的是分析食源性单增李斯特菌主要毒力因子，并对其毒力特性进行统计和筛选，旨在找到毒力基因缺失的菌株，为后续研究影响单增李斯特菌毒力的因素做基础。

应用PCR和琼脂糖电泳鉴定59株单增李斯特菌菌株的毒力因子。主要毒力基因的引物如下表：

Listeria monocytogenes毒力基因引物选择

目标基因

引物序列

片段大小

参考文献

1.hlyA

F:ATCATCGACGGCAACCTCGGAGAC

404bp

[1]

R:CACCATTCCCAAGCTAAACCAGTGC

2. prfA

F: CCATACACATAGGTCAGGATT

266bp

[9]

R:TTCG

TATAATGTCTGGCTTT

3. Iap

Iap1: ACAAGCTGCACCTGTTGCAG

131bp

[3]

Iap2: TGACAGCGTGTGTAGTAGCA

4. plcA

Forward 5-CTGCTTGAGCGTTCATGTCTCATCCCCC-3

1484bp

[2]

Reverse 5-CATGGGTTTCACTCTCCTTCTAC-3

5. actA

Forward 5-CGCCGCGGAAATTAAAAAAAGA-3

839bp

[4]

Reverse 5-ACGAAGGAACCGGGCTGCTAG- 3

6. inlA

F：CCT AGC AGG TCT AAC CGC AC

255bp

[5]

R: TCG CTA ATT TGG TTA TGC CC

7. inlB

F：TGGGAGAGTAACCCAACCAC

884bp

[7]

R:GTTGACCTTCGATGGTTGCT

8. plcB

F: GGG AAA TTT GAC ACA GCG TT

261bp

[6]

R: ATT TTC GGG TAG TCC GCT TT

9. inlC

F: AAT TCC CAC AGG ACA CAA CC

517bp

[7]

R: CGG GAA TGC AAT TTT TCA CTA

10. inlJ

F: TGTAACCCCGCTTACACAGTT

238bp

[7]

R: AGCGGCTTGGCAGTCTAATA

11. Mpl

F: TTG TTC TGG AAT TGA GGA TG

502bp

[8]

R:TTA AAA AGG AGC GGT GAA AT

R:TGTTATTAGGGACCACAAGCT

12.σB

F: CCAAAAGTATCTCAACCTGAT

643bp

[9]

R:CATGCATTTGTGATATATCGA

R: GCAGGACTCAATTTCTCAGGA

13. hpt

F: GATTTGTGCAATCACCAGGT

529bp

[9]

R: GAACCTAGCAATGCTCCAA

参考文献

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3. 研究的方法与方案

研究方法主要是 PCR 琼脂糖电泳

  • 活化
  • 菌种保存
  • 分离纯化LM
技术路线：

  • PCR
  • 配置PCR体系
  • 提取DNA

琼脂糖电泳


可行性分析：

PCR原理及其可行性：

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR 反应体系和参数　

反应体系：模板DNA 3μL、10μmol/L 上下游引物各1μL、PCR Master Mix（2ⅹ）12.5μL，补去离子水使得总体积达到25μL。

PCR 反应参数：

如 hlyA 毒力基因：94℃预变性5 min；再按94℃变性30 s，退火30s ，72℃延伸30s，共进行30 个循环；最后72℃延伸10 min。

又如 iap毒力基因：94℃预变性4 min；再按94℃变性30 s，退火60s ，72℃延伸60s，共进行40 个循环；最后72℃延伸5 min。

琼脂电泳及其可行性：琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有分子筛和电泳的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太小，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

本实验将PCR 扩增产物及2000DL 或者600DL DNA Ladder Marker 分别上样5μL，电泳。胶块在EB中浸泡20min，观察电泳结果，并对其进行分析。

4. 研究创新点

LM 鉴定方法包括传统的分离鉴定和免疫学鉴定等。分离培养鉴定法比较简单，但是操作烦琐、耗时长，不适合食品业的检测。免疫学检测法操作简便，可在同一时间内检测大量样，但由于存在交叉反应，难以对李斯特菌种间特异性进行鉴别。相比之下，应用PCR法检测具有特异性强、灵敏度高和速度快等优点。

5. 研究计划与进展

4.1-4.7 分离纯化单增李斯特菌并保存

4.8-4.9 活化、提取DNA、分装

4.10-4.14 阅读文献、搜索引物、定引物、分装引物

4.17-4.30 PCR、电泳 13个基因

4.30-5.10 验证结果

5.10-5.20 整理结果

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