四环素对蚯蚓急性毒性效应研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

抗生素(antibiotics)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌)产生的一类具有显著抑制或杀灭其他类型微生物生长或生存的代谢产物。^[1]近年来，为了进行预防大规模畜禽疾病的爆发和保障畜禽的产量及健康，大量兽用抗生素药物常作为抗菌剂和促生长剂，被广泛应用于畜牧养殖业的全生产过程。但由于畜禽往往难以在短期内将体内抗生素兽药完全代谢吸收，这些畜禽粪肥中常常残留大量抗生素，^[2]并将抗生素带入土壤环境中。抗生素的大量使用诱导动物体内产生抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes, args)，从而加速了抗性基因在环境中细菌间的传播扩散。其中，四环素类抗生素(tetracyclines)是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素（chlortetracycline)、土霉素（oxytetracycline）、四环素（tetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等，其结构均含并四苯基本骨架。四环素类抗生素难以被动物肠胃系统吸收完全，其排泄率高达 69%~86%^[3] ，因而容易残留在土壤环境中。

蚯蚓俗称地龙，又名曲鳝，是环节动物门寡毛纲的代表性动物，^[4]是营腐生生活动物。它们以土壤中的动植物碎屑为食，经常在地下钻洞，把土壤翻得疏松，使水分和肥料易于进入而提高土壤的肥力，有利于植物的生长。^[5]蚯蚓能够对许多决定土壤肥力的过程产生重要影响, 被称为"生态系统工程师"。它通过取食、消化、排泄和掘穴等活动在其体内外形成众多的反应圈, 从而对生态系统的生物、化学和物理过程产生影响。蚯蚓在生态系统中既是消费者、分解者, 又是调节者, 它在生态系统中的功能具体表现在: (1) 对土壤中有机质分解和养分循环等关键过程的影响; (2) 对土壤理化性质的影响; (3) 与植物、微生物及其他动物的相互作用。蚯蚓活动及其在生态系统中的功能受蚯蚓生态类群、种群大小、植被、母岩、气候、时间尺度以及土地利用历史的综合控制。^[6]蚓粪是指经蚯蚓堆肥处理后的有机肥料，由于其肥力高，有很好的通气性、透水性和持水性以及良好的养分供应与保持能力等特点，在有机肥中生产比例很大。蚓粪作为一种高效粪肥资源，在农业生产中被广泛使用。因此，探究四环素对蚯蚓的影响是具有很大意义的。

2. 研究的基本内容和问题

蚯蚓能够对许多决定土壤肥力的过程产生重要影响, 被称为"生态系统工程师"。它通过取食、消化、排泄和掘穴等活动在其体内外形成众多的反应圈, 从而对生态系统的生物、化学和物理过程产生影响；蚯蚓生产的肥料——蚓粪也以其高效清洁的特点广受欢迎。肠道菌群则是生活在正常状态下生物体肠道内的所有微生物的总称。其中约98%是细菌，种类丰富、数量繁多。四环素作为兽药和饲料添加剂，经动物口服或肌肉注射进入动物体内后并不能被完全吸收或代谢掉，还有约 30% —90% 以母体化合物形式随粪便排出。^[11]四环素经畜禽粪便等途径进入土壤，也会在土壤环境中长期存在，对土壤环境造成潜在威胁。^[12]在蚯蚓处理粪肥时，环境中的抗生素将随着蚯蚓的生理活动进入其肠道内，因而蚯蚓肠道成为抗生素的富集场所。大量的抗生素产生巨大的选择压力，促进抗生素抗性细菌的形成。随着蚯蚓的散布，其肠道内抗性细菌将被带入其他环境中，也对抗性细菌与抗性基因的传播有一定的影响。虽然目前已有的研究展示了无胁迫条件下蚯蚓的作用和肠道菌群组成，土壤环境中四环素进入蚯蚓体内所引起的蚯蚓肠道菌群和蚓粪菌群的变化，等等；但在蚯蚓身上，仍有许多我们尚未了解的地方，四环素对蚯蚓肠道菌群的影响正是我们需要探索的方向之一。我们也需要尽快将四环素等抗生素污染系统化、建立成熟的风险评估体系和解决问题的方案。因此，需要对四环素对蚯蚓的急性毒性效应做进一步研究，这也正是本研究的目标。

由于土壤中四环素有结合态、交换态和水溶态三种类型，而水溶态有效性最高，本研究计划于用平板和滤纸模拟土壤水相中四环素对蚯蚓的影响，通过观察不同程度、不同接触时长的四环素胁迫对蚯蚓肠道菌群造成的影响，检测四环素作用后蚯蚓肠道内容物中酶、抗生素抗性基因的变化，探究抗生素毒性作用。目前拟解决的问题有：蚯蚓解剖及肠道内容物的提取、保存、处理操作，怎样避免不同批次、不同蚯蚓个体差异造成的误差，抗生素抗性基因的提取与鉴定方法，等等。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

本实验计划采集江苏省常见的青蚯蚓，选取质量相近的活跃蚯蚓，分别放入铺设有滤纸的培养皿中，分组以0，500,1000，1500，2000，2500ppm浓度的四环素处理24、48h；获得不同处理下存活的蚯蚓，解剖并得到肠道内容物。然后测定处理后肠道内容物中sod、cat、pod三种酶的活性，对于处理后蚯蚓肠道内容物中功能基因进行定量分析，通过高通量测序手段获取0、500、1000ppm浓度四环素处理后肠道中细菌的信息，得到系统发育树等数据。

技术路线：

4. 研究创新点

蚯蚓作为一种重要的土壤生物，在堆肥处理和农业应用上都有重要作用，其广泛的活动范围及应用途径也使其在抗性细菌的传播中可能起到重要作用。而目前我国对蚯蚓及其生态作用研究仍不够重视。过往研究人员往往注重于蚯蚓生理作用或蚯蚓在农业生产的应用，或注重于蚯蚓所代表的土壤动物受抗生素影响，鲜少将抗生素、抗生素抗性基因与蚯蚓的生产作用联系起来，即对抗生素影响后的蚯蚓肠道内容物展开分析。本实验预计以滤纸、土壤培养蚯蚓，设置不同浓度的四环素处理对照并进行比较，再对解剖得到的蚯蚓肠道内容物进行分析，从而较深入细致地探究四环素对蚯蚓的急性毒性效应。

5. 研究计划与进展

2019.10-2019.12查阅资料

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