有机肥部分替代化学养分对土壤生物性状的影响研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题研究意义：

长期以来，化肥和农药的大量使用导致了土壤生态系统退化、土壤结构破坏以及粮食产量增长缓慢甚至产生负增长等诸多问题。有机肥以其来源广、养分全面、肥效长和污染少等优越性，已逐渐成为替代化肥施用的肥料类型，有机肥替代部分化肥必然是我国今后肥料发展和使用的趋势。目前，有机肥部分替代化学养分技术已经被证实具有达到农作物增产的效应，但其对土壤微生物群落结构的重构和对功能的改善的影响和机制尚不明确。本课题将通过比较不同有机肥在不同土壤中对土壤微生物群落结构和活性的改变，阐明其对土壤微生物生物量、酶活性、微生物群落结构和功能的影响，为有机肥替代化肥的生物学机制和潜力评估提供科学依据。

国内外研究现状概况及应用前景：

2. 研究的基本内容和问题

研究目标 ：

比较不同有机肥在不同土壤中对土壤微生物群落结构和活性的改变，研究其对土壤微生物生物量、酶活性、微生物群落结构和功能的影响，为有机肥替代化肥的生物学机制和潜力评估提供科学依据。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

实验选用六种土壤：红壤、黑垆土、塿土、褐土、潮土和黑土，红壤采集自江西省南昌市进贤县（28°21'4.56"N,116°9'59.7" E），农作制度为花生，油菜，芝麻轮作；黑垆土采集自陕西省延安市洛川县永乡镇（35°47'19"N，109°34'56"E），农作制度为夏玉米，冬休闲模式；塿土采集自陕西省咸阳市杨凌区（34°17'58"N，108°04'09"E），农作制度为夏玉米，冬休闲模式；褐土采集自河北省石家庄市藁城区马庄村马庄农场（37°92′N，114°78′E），农作制度为小麦玉米轮作，一年两熟常年产量，玉米600kg/亩，小麦500kg/亩；潮土采集自河北省衡水市深州护驾迟（37°54′12″N，115°42′15″E），农作制度为小麦玉米轮作，农民常规管理措施；黑土采集自吉林省长春市公主岭朝阳坡镇（43° 37'8"N，124° 47' 16"E），农作制度为玉米连作，5月初播种、10月初收获。有机肥选用牛粪有机肥和猪粪有机肥。

根据相关有机肥的田间常规施用量为基准设计土壤室内培养试验，采集样品后测量其相关理化指标、生物学指标和微生物学指标，并进行数据整理分析，探明有机肥对土壤生物性状的影响，揭示有机肥与土壤微生物的相互作用，从而为有机肥替代化肥的生物学机制和潜力评估提供科学依据。

技术路线：

实验方案：

(1)实验材料

①供试土壤：

红壤、黑垆土、塿土、褐土、潮土、黑土。红壤采集自江西省南昌市进贤县（28°21'4.56"N,116°9'59.7" E），农作制度为花生，油菜，芝麻轮作；黑垆土采集自陕西省延安市洛川县永乡镇（35°47'19"N，109°34'56"E），农作制度为夏玉米，冬休闲模式；塿土采集自陕西省咸阳市杨凌区（34°17'58"N，108°04'09"E），农作制度为夏玉米，冬休闲模式；褐土采集自河北省石家庄市藁城区马庄村马庄农场（37°92′N，114°78′E），农作制度为小麦玉米轮作，一年两熟常年产量，玉米600kg/亩，小麦500kg/亩；潮土采集自河北省衡水市深州护驾迟（37°54′12″N，115°42′15″E），农作制度为小麦玉米轮作，农民常规管理措施；黑土采集自吉林省长春市公主岭朝阳坡镇（43° 37'8"N，124° 47' 16"E），农作制度为玉米连作，5月初播种、10月初收获。上述土壤基础理化特性如表1所示。

②供试肥料：

有机肥选用牛粪有机肥和猪粪有机肥。供试肥料基础理化特性如表2所示。

表1：供试土壤基础理化性质

表2：供试肥料基础理化性质

(2)实验设计

①施肥处理：

模拟培养试验采用长×宽×高 = 35 cm×25cm×25cm的周转箱作为培养器皿，将过5 mm筛的均质土壤按照干土重为5 kg的标准添加进入周转箱内，并保证土壤剖面高度为20 cm，与田间采样标准一致。

肥料添加以按照每亩土壤(150000 kg)1000 kg有机肥的田间常规施用量为基准；设置与田间肥料施用量(1000kg/亩)等同的处理组，分别施用牛粪有机肥与猪粪有机肥；与上述情况相对应的设置田间常规施用量三倍的处理组；在以上施肥处理基础上，按照有机肥料氮磷钾元素含量为基准设置对应的一倍量和三倍量的化学养分施用处理组，其中氮肥选用尿素 (0.20 g·kg^-1 / 0.60 g·kg^-1)，磷肥选用KH₂PO₄ (0.22 g·kg^-1 / 0.66 g·kg^-1)，钾肥在KH₂PO₄施用的情况下补充KCl(0.17 g·kg^-1 / 0.51 g·kg^-1)；同时，设置无肥组作为对照组。以上处理均设置三个重复，所有实验均进行一次施肥，每间隔一月进行多次采样。

②培养条件：

本实验在资环学院日光温室中进行，土壤均匀盛放在聚乙烯周转箱内进行培育。室内培养温度控制在25 ℃，每隔3-5天采用称重法调节土壤含水率，保证土壤含水率稳定在土壤田间最大持水量的60 %左右。

③测定指标及方法：

1．土壤生物学性质指标

包括土壤呼吸、微生物生物量碳、微生物生物量氮、土壤酶活性（α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、纤维二糖酶、木糖酶、亮氨酸氨基肽酶、氨基葡萄糖苷酶、磷酸酶、过氧化氢酶、酚氧化物酶）等。具体方法如下。

1.1土壤呼吸：

采用密闭气室法对土壤基础呼吸速率进行测定。将一无底无盖的管状容器的一端插入土壤中，经过一段时间内的稳定后，加盖，用一针状连接器以一定的时间间隔抽取气体样品进入真空容器内，用气相色谱仪或红外分析仪测定其中CO2的浓度，计算得出CO2排放的速率。

1.2土壤微生物生物量：

采用限制性末端长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,tRFLP)。这是一种分析生物群落的指纹技术，它的基础原理涉及末端荧光标记的PCR产物的限制性酶切。利用基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA。采用细菌特异性引物27F/1492R进行PCR扩增，其中27F的5’端用荧光标记，通过PCR反应体系和反应程序进行扩增。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，用DNA胶回收试剂盒进行割胶纯化。纯化产物用限制性内切酶HhaI/MspI消化，反应体系为10×Buffer2μl，HhaI/MspI1μl，DNA400ng，ddH2O补足至30μl。将酶切样品置于37℃水浴3h，酶切完毕后于65℃水浴10min使酶失活终止反应。酶切产物进行基因扫描，得到tRFLP图谱。删除限制性片段（T-RF）大小小于50bp和荧光值小于50荧光单位的T-RF。峰值图上峰所对应的横坐标代表T-RF的片段长度，纵坐标代表含有荧光物质T-RF的荧光强度，峰面积则代表具有相同片段长度的T-RF荧光强度之和，该值可用于表示该菌种的相对数量，再根据菌液的总细胞数计算各个菌株的相对数量。

土壤微生物生物量碳（MBC）和氮（MBN）采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法。熏蒸及未熏蒸土样以1：4（土：水，w:v）加入0.5 moll^-1硫酸钾浸提剂，180 r/min震荡30 min后过滤。待测液中总碳用总有机碳分析仪测定，总氮用流动分析仪测定。熏蒸与未熏蒸土样的有机碳氮差值分别除以转换系数（KC=0.38，KN=0.45），分别计算MBC和MBN含量。

2.土壤微生物群落指标

包括真菌及细菌微生物群落组成和结构，通过biolog微平板法进行测定。

可行性分析：

本课题组前期已长期进行相关研究，已经有良好的实验基础，目前土壤培养试验及采样工作有序进行中，且课题组所在研究室是我国高等院校中最早成立的土壤生态专业研究机构之一，长期致力于土壤生态系统的研究工作，在土壤微生物群落组成、功能以及物种相互作用方面积累了相当丰富的科研成果，相关的微生物学和分子生物学分析仪器和实验设备齐全。

4. 研究创新点

目前国内外关于有机肥对土壤理化性质的影响已有很多研究，有机肥对土壤质量提升和作物增产不容置疑，但对土壤微生物群落结构的重构和对功能的改善的影响和机制尚不明确。本实验通过设置在我国几种典型的土壤中施用不同类型的有机肥处理，比较不同有机肥在不同土壤中对土壤微生物群落结构和活性的改变，研究其对土壤微生物生物量、酶活性、微生物群落结构和功能的影响，从而为有机肥替代化肥的生物学机制和潜力评估提供科学依据。

5. 研究计划与进展

①2020年2月-2020年3月：

查阅相关文献，撰写文献综述及开题报告。

②2020年3月-2020年5月：