通过作为生物过滤器的三叶草吸收和生物降解抗微生物磺胺嘧啶，并通过厌氧消化和伴生沼气生产进一步生物降解外文翻译资料

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通过作为生物过滤器的三叶草吸收和生物降解抗微生物磺胺嘧啶，并通过厌氧消化和伴生沼气生产进一步生物降解

Ariel E. Turcios, Dirk Weichgrebe, Jutta Papenbrock

摘要

该项目分析了抗菌磺胺嘧啶（SDI）从培养基中的摄取和生物降解，直到厌氧消化。 在不同浓度的SDI（0,5和10 mg·L^-1）的水培条件下生长三聚磷酸钠，并将含有不同量的SDI的新鲜生物质用作沼气生产的底物。 通过与正离子电喷雾质谱联用的液相色谱（ESI LC-MS）分析SDI。 根据调查结果，T. pannonicum能够吸收SDI。 SDI在培养基中越多，植物组织中的SDI含量越高。 根据这项研究，可以使用包含SDI的T.pannonicum生物量来生产高产量的沼气，同时进行SDI的生物降解。 以5mg·L^-1 SDI播种的植株的枝条作为底物获得最高的特异性沼气产量。

关键词：厌氧消化 LC-MS分析 植物修复 磺胺嘧啶降解 T·pannonicum植物

1. 介绍

水生环境中抗菌素的出现一直在增加。在欧洲的大多数国家，已经观察到越来越多地使用广谱抗生素，例如阿莫西林和克拉维酸的组合，新的大环内酯类，喹诺酮类，头孢菌素类，青霉素类，四环素类（TC）和磺酰胺类（SA）(Goossens 等，2005)。四环素和SA主要用抵抗对细菌和作为生长促进剂的兽药。这些抗生素在肠道中吸收不良，因此会随着大量的尿液和粪便排泄。多达90％的SA可能作为母体化合物排泄（Kim等人，2011）。这些残留物通过污水排放物进入环境，到达其他水体，因此，其存在越来越多地被认为是出现抗微生物抗性细菌的主要原因（Lindsey等人，2001）。在饮用水处理厂的源水中发现一些抗生素，包括磺胺甲恶唑（3.0-3.4 ng·L^-1），大环内酯类（1.4-4.9 ng·L^-1）和喹诺酮类（1.2-4.0 ng·L^-1）（Ye和Weinberg ，2007）。Lindsey等人（2001）报道了地下水和地表水中TC和SA浓度范围为从0.07至gt; 15 mu;g·L^-1，而在不同的液体粪便样品中，磺胺嘧啶（SDI）已发现在1-2 mg·kg^-1范围内（Christian 等，2003年），在德国的一些沼气工厂中，已报道了几种抗生素（包括SDI），其浓度高达9 mg·kg^-1（Spielmeyer等人，2014）。

一些研究已经证明，一些药物在常规废水处理和排放到接收水域中不会被完全消除（Gros等人，2012; Ternes等人，2004）。因此，重要的是使用能够去除这些化合物的有效和低成本的技术。 作为吸收有机污染物的生物过滤器的植物具有潜在的用途，是处理废水的一种经济有效的方法（Turcios和Papenbrock，2014）。由于在一些厌氧处理的废水中含有浓度范围从10 g·L^-1到71 g·L^-1的溶解盐（Lefebvre和Moletta，2006），因此所选择的植物需要有足够的耐盐度才能形成弹性和有效的生物过滤系统 （Calheiros等人，2012）。三叶草是一种盐生植物，可以承受高达45 g·L^-1 NaCl的盐度条件（Turcios等，2016）。 此外，在水培条件下，这种植物物种表现非常好，其中含有低浓度硝酸盐和磷酸盐（分别为10mg·L ^-1 N和0.3 mg·L^-1 P）的盐水不会限制生物量的生产和生物过滤能力（Buhmann 等人。 2015），并且还可以重复收获（Ventura等人，2013）。在这种情况下测试耐盐植物物种T.pannonicum以便在水培条件下降低抗菌SDI的含量。 此外，这种植物物种能够吸收其他化学品污染物如硝酸盐和磷酸盐（Buhmann和Papenbrock，2013; Buhmann等，2015），从而可以避免接收水体的潜在富营养化。选择抗菌SDI是由于其在牲畜中的高度使用，在环境中非常普遍，另一方面由于其不易被吸附，更精确地遵循摄取和生物降解过程。另一个问题可能是作为生物过滤器的植物生物量的使用。 因此，提出了进一步利用这种植物材料进行沼气生产，作为可再生能源。 到2020年，欧盟内部能源需求的20％应由太阳能，风能或生物质等可再生能源系统产生（Spielmeyer等，2014）。另外，在厌氧消化过程中，抗生素的生物降解可能发生。 只有有限的关于消除发酵过程中的抗生素的信息是可能的，到目前为止还不完全清楚降解是否发生。

在这方面，本研究的主要目的是评估植物物种T.pannonicum对SDI的摄取和生物降解，其在植物中的分布，和它在厌氧条件下进一步的生物降解以及评估SDI对沼气生产的影响。

1. 材料和方法

2.1 植物栽培

在德国北海（53°29′13Prime; N; 8°03′16Prime;E）收集三叶草的种子。用Buhmann等人描述的方法进行从播种到移植的农艺处理。 （2015）。从2015年11月至2016年1月，T.pannonicum植物在不同的SDI浓度（0，5和10 mg·L^-1）下生长。所有植物移植后在水培条件下种植5周。这些实验在德国莱昂比斯大学植物学研究所（52°23 ′42Prime;N; 9°42′13Prime;E）的温室中进行，其中温度在14℃（夜间最低温度）和35℃（白天最高温度）之间。将植物暴露在人造光（钠蒸汽灯，SONT Agro 400，Philips）下12小时。 根据一年中的时间，一天中的时间以及天气条件，光强度范围定为65mu;mol·m ^-2·s ^-1〜850mu;mol·m ^-2·s ^-1。使用容量为16L的聚丙烯容器（400mmtimes;300mmtimes;175mm）。 每个容器具有含有13L药物，包括606mg·L^-1KNO₃，944mg·L^-1Ca（NO₃）₂·4H₂O，230mg·L^-1NH₄H₂PO₄，

246mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，3.73mg·L^-1KCl，1.55mg·L^-1H₃BO₃，0.34mg·L^-1MnSO₄·H₂O，

0.58mg·L^-1 ZnSO ₄·7H ₂ O，0.12mg·L^-1CuSO₄·5H₂O，0.12mg·L^-1MoNa₂O₄·2H₂O，

和9.16mg·L^-1 Fe-EDDHA（0.56mg·L^-1Fe）。每个水箱的中间部分都有小压缩机和一个气石（Eheim，Deizisau，Germany）来不断给水充气。 下胚轴用35mm孔的软泡沫固定。 每个水箱用自来水不断调整水位，以补偿蒸发量。每个实验单位由单个含有八个植物的容器组成，每次处理三个技术重复。 在相同条件下（0，5和10 mg·L^-1 SDI）但没有植物的三个额外容器同时进行，目的是监测由于环境条件导致的SDI退化的影响。 收获后，用去离子水洗涤植物的不同部位（幼叶，幼叶，茎，芽和根），用吸水纸除去水，并立即在液氮中冷冻。 提取前植物样品应保存在80℃的条件下。

2.2 植物样品制备

为了优化SDI提取，在使用二十一种方法后（表A.2），应用以下方法。将植物样品在液氮中研磨成细粉末。 将约100mg新鲜和压碎的植物材料在2mL反应管中称重。 然后为了SDI提取进行酸水解。 加入萃取缓冲液（1000mu;L，在甲醇中有1％甲酸 （体积比））。 样品以每分钟1000次的频率在室温下振荡4小时（Eppendorf Thermomixer Compact，Hamburg，Germany）。 然后加入1000mu;L水解缓冲液（在甲醇中有10% HCl（体积比）），并在85℃加热40分钟。冷却后，将样品以10,000转每分钟的转速（9279g）离心5分钟。 对于来自植物地上部分的样品，将500mu;L的上清液在500mu;L80％MeOH中稀释。 对于来自根的样品，进行1:200的最终稀释（在80％MeOH中）。 向样品中加入内标（西玛通），达到最终浓度为100 ng·mL^-1。在提取过程中使用对照样品，因为85℃的温度可能导致抗生素物质的一些损失。 对照包含与样品相同量的植物材料，但是是在不存在抗生素的情况下生长的植物。 对于这些对照，在提取过程中用与其余样品相同的方式加入一定量的抗生素处理。

2.3 甲烷活性试验

根据VDI 4630方案进行沼气试验程序。 实验从2016年2月至2016年3月进行。使用来自T.pannonicum作为底物的新鲜植物材料，在不同的SDI浓度（0，5和10 mg·L^-1）下培养。 同时，使用T.pannonicum作为底物进行第二个实验，但是在没有SDI的情况下进行培养。在本实验中，将不同量的SDI加入到厌氧反应器（0，0.1和0.5mg·L ^-1）中。 使用体积为1000mL的玻璃瓶作为测试间歇反应器。 每个反应器含有200mL介质（污泥颗粒，去离子水和底物）。 在底物和接种物（污泥）之间测定干物质（DM）和挥发性固体（VS）含量。干物质根据DIN EN 12880测定。根据DIN EN 12879测定VS含量。

用作接种物的颗粒是从废水处理厂的消化器（德国riha WeserGold Getrauml;nkegruppe,Behrenstraszlig;e 44-6, 31737 Rinteln）取出的。 将新鲜植物材料（底物）与接种物以0.5 VS底物/ VS接种物的比例混合。 每个样品（含有接种物，底物和去离子水）和作为空白的三个重复组（仅含有接种物和去离子水）重复使用三次。 所有瓶子都装满相同量的接种物。 对于每个底物，将计算的量加入三个重复反应器中的每一个。

将反应器用氮气冲洗约1分钟以促进厌氧条件，并且紧密封闭在37℃下温育。 使用手持设备进行测试，每天用压力计将压力读数传入反应器。 当每天的生物沼气率低于生产的总沼气浓度的0.5％（30 d）时，测试终止。 完成实验后，取气体样品进行气相色谱分析，以确定原始沼气样品中甲烷的分数。 根据Gay-Lussac定律计算沼气和甲烷体积，并在正常条件（273.15 K和101.325 kPa）下转化为气体体积。 溶解的沼气进入液相，根据亨利定律分别量化和计算。

2.4 消化样品制备

在厌氧条件下30天后，将样品均化并收集在15mL聚丙烯离心管（Sarstedt AG＆Co，Nuuml;mbrecht，Germany）中。为了提取，将1mL样品转移到2mL反应管中并进行管理与植物组织相同。加入500mu;L提取缓冲液（2％甲酸的MeOH v /v）溶液。将样品在室温下在1000分钟-1振荡4小时（Eppendorf？Thermomixer Compact）。然后加入500mu;L水解缓冲液（20％HCl的MeOH v/v）溶液，加热至85℃40分钟。冷却后，将样品在10,000转每分钟（9279g）下离心5分钟。对于含有植物地上部分的消化物作为底物，将500mu;L上清液在500mu;L80％MeOH中稀释。将含有根的消化物作为底物，进行1:200的最终稀释（在80％MeOH中）。向样品中加入内标（simeton），终浓度为100 ng·mL^-1。以与上述相同的方式使用对照样品（第2.2节）。为了研究基质效应，将一定浓度的SDI加入到厌氧培养基中，然后对SDI的浓度进行定量。

2.5 抽水程序

在实验过程中，从植株生长当天的培养基中收集样品，并在收获当天进行最后一次采样。 为了研究环境条件对抗生素的影响，在相同条件下（0,5和10 mg·L^-1 SDI）的实验，开始和结束时也从其他三个容器中取水样， 但没有植物。 将源水样品在0.22微米孔径（卡尔·罗斯，卡尔斯鲁厄，德国）上过滤，然后在70℃保存。 对于LCMS分析，将样品在80％甲醇（MeOH），LC-MS级中稀释（1:100）。 并且研究了不同矩阵的影响。 为此，将一定浓度的SDI加入到植物生长的培养基中，然后通过LC-MS分析样品。

2.6 LC / MS的条件，定量和线性

通过装备有两个溶剂输送单元（LC-20AD XR），自动进样器（SIL-20AC XR），光电二极管阵列检测器的高效液相色谱（HPLC）系统（Shimadzu，Canby，USA） （SPD-M20A）和柱式烘箱（CTO-20AC）。使用Vertex Plus色谱柱（250-4mm，5lm孔径，包装材料ProntoSIL 120-5 C18-H）和相应的前柱（Knauer，Berlin，Germany）分离分析物。分析物在20分钟内分离鉴定，因此每个样品的总运行时间为30分钟。使

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