反硝化生物过滤器中一氧化二氮积累对跨越温度梯度的遗传关联的定量反应外文翻译资料

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反硝化生物过滤器中一氧化二氮积累对跨越温度梯度的遗传关联的定量反应

摘要

在大气中增加的一氧化二氮（N₂O）是全球关注的。生物滤池已经在饮用水环境中进行了氮气处理研究。然而，介导反硝化生物过滤器中N₂O积累的分子机制尚未量化。本研究开发了5种脱氮生物过滤器，全氮（氮：72.4-92.7％），硝态氮（NO₃-N：88.6-98.2％）和化学需氧量（COD：79.3-90.0 ％）穿过低温梯度（5-25℃）。与厌氧铵氧化（ANAMMOX）和硝酸还原硝化还原到铵（DNRA）工艺的脱氮耦合产生了目前强大的处理性能。在5-15℃，硝化可用性有限的TN去除。我们的发现表明温度影响N₂O间接通过控制亚硝酸盐与携带微生物的N₂O还原酶的平衡间接产生。此外，我们的研究结果表明，遗传相关性是反映低温下N₂O积累的相对强度的重要指标。

1.简介

由于农业集约化，工业化和城市化造成的污染，饮用水中氮和有机质的增加与健康问题有关。这个问题已经成为中国水短缺地区特别关注的问题。主要受有机碳和氨化合物污染的水通常被称为微污染水。预处理微污染水对于去除过量的氮和其他污染物至关重要。在此背景下，出现了低成本和环保系统的发展对微污染水的整治越来越大的兴趣。

生物过滤器已被开发用于消除各种形式的废水污染物，包括雨水，农田径流，城市污水和工业废水。生物过滤系统设计人员已经开始考虑水过滤系统如氧化亚氮的有效温室气体排放副产物的重要性。

在反硝化反应中生产和排放一氧化二氮是有问题的，可能加速臭氧破坏和全球变暖。生物脱氮是一种酶促催化的顺序还原过程，涉及几种关键功能基因，其微生物有机体已被用作分子标记物。然而，关于遗传和环境变量的因果关系及其对脱氮生物膜中N₂O积累的定量影响知之甚少。在低温条件下，脱氮生物过滤器中N₂O积累的精确调节剂是不确定的。在分子水平上预测N₂O积累对于保护当地土壤环境而言，对全球的环境也很重要。

已经显示某些温度条件与湖泊和农业生态系统中的N₂O生产相关。然而，这些相关性仅表明温度影响N₂O积累，但不提供关于这些影响是否通过其遗传组成的变化适应或抑制微生物群落的信息。庞等（2015年）表明，潮汐流建设湿地条件下的寒冷温度约束反硝化，反硝化菌适应能力随长期厌氧有氧交替条件下的温度变化。尽管在以前的研究中已经对自然和受控环境中的脱硝器进行了研究，但是关于N₂O积累的变化是否直接取决于温度或通过遗传变量间接影响的问题，几乎没有确凿证据。

在这项研究中，我们调查了遗传变量，可能会阻止N₂O在五个反硝化生物过滤器中的温度梯度上的积累。本工作的目的是：1）调查基因丰度和N₂O积累率; 2）量化基因丰度和温度在N₂O累积率中的相对重要性和随机相关性; 和3）揭示脱氮生物过滤器脱氮的主要分子机制，并确定低温约束下N₂O积累的分子驱动力。

2.材料和方法

2.1脱氮生物滤池的设置和运行策略

使用有机玻璃构建了五个实验室规模的脱氮生物过滤器，其有效体积为8.4L（内径：90mm，高度：1800mm）。将反应器的顶部密封以形成厌氧环境。从澳大利亚Joyce Foam Products购买的网状聚氨酯泡沫塑料被固定为载体材料。聚氨酯泡沫的密度为28kg / m³; 抗拉强度150kPa;抗撕裂性650N / m; 每25 mm，90plusmn;10; 孔径为300-500mu;m。聚氨酯泡沫在生物过滤器中被切割成高度为1200mm的形状。在聚氨酯泡沫的顶部和底部安装有筛板。使用循环水浴装置控制温度。 合成废水通过计量泵（ProMinent，中国）在生物过滤器底部设置有可编程定时器连续泵送，经处理的废水通过出口管从反应器顶部排出。

整体实验由适应和操作时期组成。合成废水通过加入30mg/LKNO₃，300mg/L CH₃COONa，15mg/L NH₄Cl，3.0mg/L KH₂PO₄，100mg/L MgSO₄·7H₂O，23mg/L CaCl₂，3.0mg/L FeCl₃·7H₂O和12mg/L NaHCO₃与当地供水网络的自来水。将新鲜制备的废水中的pH调节至7.2plusmn;0.1。为了最大限度地减少目前生物膜冲击的影响，第0-42天的水力负荷保持在10 cm/d，从第43天上升到40 cm/d。硝态氮的进水浓度增加从30 mg/L到100 mg/L，以促进微生物的生长。在适应期的最后一天，硝态氮去除效率达到90％，生物膜在聚氨酯泡沫表面可见。适应期水温保持在25℃。之后，温度逐渐降低，而其他变量则随着实验的进行而保持：第一阶段（T = 25℃），从4月28日到5月18日; 5月21日至6月10日第二阶段（T = 20℃）; 6月13日至7月4日第三阶段（T = 15℃）;七月七日至七月二十七日的第四阶段（T = 10℃）;和5月30日至8月19日的V级（T = 5℃）。

2.2样品收集和分析

在整个作业过程中，每三天在入口和出口收集水样，并立即在北大水与沉积科学重点实验室进行分析。 每次测量每个位置的一式三份水样，以确定水质。使用HACH DR2800（美国HACH）多功能水质测试仪测定变量，包括总氮（TN），NO₃-N，亚硝酸氮（NO₂-N），铵态氮（NH₄ N）和化学需氧量（COD）（APHA等，2012）。

在每个操作阶段的最后一天进行气体和微生物取样。每次抽真空和取样袋收集一式三份气体样品。真空（Becker，德国）连续运行直至绝对真空度降至0.03MPa。 测量气体体积并用于计算24小时内的平均产生率。然后，对实验室中的气体样品进行N₂O浓度的分析（Kampschreur等，2008）。 在6890N气相色谱仪（Agilent，USA）上测定气体样品组分，具有以下操作条件：PEG-20 M毛细管色谱柱（0 mtimes;0.53 mmtimes;1.00micro;m）;柱温40° C; 检测器温度250℃，注入口温度150℃，补充气流量60mL/min，柱流速5mL/min，注射柱100mu;L。

在每个操作阶段结束时的五个位置收集微生物样品。采样位置分别设置为5个深度（0-24厘米，24-48厘米，48-72厘米，72-96厘米和96-120厘米）。在每次取样期间，取四份或五份样品并充分混合。每次收集后，将微生物样品储存在冰培养箱中，送到北大水质与沉积科学重点实验室进行分析。D5625-01土壤DNA试剂盒（Omega，USA）用于从微生物样品提取和纯化总基因组DNA。提取的基因组DNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测到并维持在-20◦C冰箱用于进一步分析。

2.3定量聚合酶链反应（qPCR）

为了比较五种温度条件下N₂O的积累速率和微生物的存在，使用qPCR对数个功能基因的丰度进行了定量。16S rRNA基因用于评估厌氧二氧化铵氧化（ANAMMOX）细菌，古细菌和总细菌的丰度，而narG，napA，nirK，nirS，qnorB和nosZ基因用于评估不同组的脱氮剂。

qPCR在ABI PRISM 7300（Applied Biosys-tems，USA）上进行。表S2中的正向和反向引物用于扩增过程。 我们使用特异性克隆酶TransTaq-T DNA聚合酶（TransGen Biotechnology Company，Beijing）作为聚合酶。PCR反应混合物包含如下：10mu;lL SYBR Green Mixture（Applied Biosystems，USA），2.5-10pmol引物对，1.0mu;LL扩增DNA和0.625U Taq聚合酶。加入无菌水直到反应达到总共20？L体积。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

使用含有功能基因的质粒作为定量标准。将从PCR扩增得到的特异性基因片段与pEASY-T3（北京TransGen Biotechnology Co.Ltd。）连接，随后克隆入Trans1-T1感受态细胞（北京TransGen生物科技有限公司）。然后将菌株在氨苄青霉素（50mg / L）板上筛选，并在37℃密闭孵育。使用蓝白色选择方法选择菌落/染色。PCR和限制性内切核酸酶分析用于质粒鉴定/鉴定，随后将产品送至上海生物工程有限公司进行测序。使用TIAN纯Mini质粒试剂盒（天然生物技术公司，中国）提取重组质粒并纯化。MyiQ2核酸蛋白质量系统（Bio-Rad，USA）用于测定纯化的重组质粒的质量浓度。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳验证PCR产物，并在-20℃下储存以供进一步使用。每个实时PCR扩增共40个循环。通过熔解曲线分析确定的重组质粒产生标准曲线。使用无菌水作为阴性对照产生标准曲线。进行三次重复以评估qPCR功能基因的标准曲线。每个重复的每个标准曲线的每个R²值超过0.99。

2.4统计分析

通过水力停留时间平均计算出流出物浓度与流出物浓度的差异，计算出NO₃--N的转化率。通过水力停留时间计算排放浓度平均值，计算NO₂--N、NH₄ -N和N₂O的积累速率。

使用SPSS 19软件（IBM，USA）进行基因片段和N₂O累积率之间的斯皮尔曼相关分析。通过单变量方差分析测试基因丰度的差异，然后进行多范围检验（Tukeys检验）。在分析之前，使用Box-Cox转化来转化所有不正常分布的变量（Bru等，2010）。使用双向可变消除法进行逐步多元回归（SMR）分析。基于F统计量测试SMR中的错误。在每个步骤中，反硝化率的预测因子选择为0.05显着性水平。 使用R（版本2.12.2）中的sem包的结构方程模型函数（Fox，2006）对方差 - 协方差矩阵进行路径分析。通过去除线性回归中最大可行性值的路径来调整模型，直到所有路径在0.05水平上显着。拟合优度由最大似然相对卡方优度测试（CMIN / DF），Joreskog的拟合优度指数（GFI）和近似均方根误差（RMSEA）来描述。CMIN / DF小于4，GFI大于0.9，RMSEA小于0.08的模型被认为是可接受的（Shipley，2002）。

3结果

3.1去除性能和氮循环率

随着温度从5℃升高到20℃，TN和NO₃-N去除效率分别从86.6％和97.2％降至62.4％和78.6％。之后，随着温度从20℃升高到25℃，TN和NO₃-N去除效率分别提高到80.7％和93.2％。最大COD去除效率达到了15℃，当温度从15℃升至20℃时，观察到从90.0％下降到79.3％。 COD去除效率在79.3％〜90.0％之间，波动幅度不同，差异不显着（Pgt; 0.05）。

随着温度从5℃升高到15℃，NO₃-N转化率保持在24.0-24.5g/m³h的高水平，并在20℃下降至19.6g / m³h 当温度从20℃升高到25℃时，观察到增加。NO₂-N积累率在15℃升高达到4.0g/m³h，之后观察到总体下降。

随着温度从5℃升高到10℃，N₂O积累速率从7.6g / m³h缓慢上升到7.7g/m³h，在15℃达到13.6g/m³h的平台。 随着实验的进行，观察到N₂O积累的急剧下降，温度从15℃升高到25℃（P lt;0.05）。

图1：温度对（a）TN，NO₃-N，NO₂-N和NH₄ -N去除速率的影响，（b）COD去除速率的影响，（c）NO₃-N的转化速率和 NO₂-N在不同温度下的积累速率的影响。

图二：温度与（nirK nirS）/ nosZ比的关系和N₂O的累积速率r表示（nirK nirS）/ nosZ比和N₂O的累积速率之间的相关系数。

3.2丰富的氮循环基因

总细菌16S rRNA的丰度比古细菌16S rRNA在整个梯度上高（4-6个数量级）（P lt;0.05）。随着温度从5℃升高到25℃，细菌16S rRNA的丰度范围为2.5times;10⁹拷贝/g〜7.8times;10⁹拷贝/g，而古细菌16S rRNA的表达量范围为1.4 times;10³份/克至2.6times;10⁵份/克。10S时总细菌和古细菌16S rRNA的丰度明显高于其他温度（P lt;0.05）。古菌16S rRNA的丰度与N₂O的累积率高度相关。然而，N₂O的积累速率与总细菌16S rRNA的丰度之间没有发现显着的关系（Pgt; 0.05）。

当温度从5℃升至25℃时，ANAMMOX 16S rR

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