用N2生成反硝化菌株接种减轻了用家禽粪便施肥的农业土壤中N2O的排放外文翻译资料

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DOI 10.100/00374-014-098-7

SHORT COMMUNICATION

用N2生成反硝化菌株接种减轻了用家禽粪便施肥的农业土壤中N2O的排放

Tomoyasu Weishou amp; Aihua Quan amp; Ayaaki kai amp; Kanako Tago amp; Satoshi Ishi amp; Weishou amp; Kazuo Isobe amp; Shigeto Otsuka amp; Keishi Senoo

收稿日期：2014年1月22日/修订日期：2014年3月24日/接受日期：2014年4月4日/在线发布日期：2014年4月18日# Sprer-verlag 柏林海德堡2014

摘要：颗粒状禽粪被推荐作为化肥的替代品用于农业土壤；然而，施用的粪肥通过反硝化作用刺激土壤中的氧化亚氮（N2O）排放。为减轻颗粒禽粪施用引起的N2O排放，建立了土壤微观世界;每个微观世界接种先前从稻田土壤中分离的以下N2生成的反硝化菌株之一：Azoarcus，Dyella ， Dechloromonas ， Niastella 和Burkholderia 。当颗粒状家禽粪便自身培养时，通过反硝化产生N2O。相反，当粪肥接种大部分N2生成菌株时，N2O排放显着降低。在土壤微观世界中，施用沉淀粪肥后孵育期间排放N2O，而当土壤接种Azoarcus sp，KS11B，Niastella sp，KS31B或Burkholderiasp时，N2O通量显着降低。TSO47-3在孵化的第12天。此外，在施用之前，将沉淀的粪肥用菌株接种

在土壤微观世界中，N2O排放水平显着降低至约来自未接种对照的40-60％。我们的研究提供了一种技术原型，该技术利用微生物技术减轻受颗粒禽粪施肥的农业土壤中的N2O排放。

关键词：旱地土壤 沉淀粪肥 氧化亚氮 反硝化细菌 减缓

介绍

农业土壤是一氧化二氮（N2O）（一种非二氧化碳温室气 体 ）和 一 种 臭 氧 消 耗 物 质 的 主 要 来 源（Ravishankara等。2009;Reay等。2012).日本的相关研究，由于

人类活动，农业土壤约占N2O排放量的26％（日本国家

T. Nishizawa:A。泉:一个。凯:W上。沉:K。矶部:S上。大冢:

K. Senoo

东京大学农业与生命科学研究生院应用生物化学系， 东京113-8657，日本

T. Nishizawa (*)

茨城大学农学院生物资源科学系，日本茨城市阿美3-21-1

Chuou 300-0393

电子邮件：nishitom@mx.ibaraki.ac.jp

K. Tago

环境生物功能处，国立农业环境科学研究所，茨城县305-8604，日本

S. Shiii

北海道大学环境工学系，北海道060-8628，日本

温室气体清单报告，2011）。来自农田的N2O排放主要 来自施用于土壤的肥料中所含的N.各种类型的化学和 有机氮肥可以成为N2O排放源（Bouwman等。2002;秋山 和鹤田2003;鲍尔等人。2004).在有机肥料中，由于其 颗粒状质地，低水分和相对稳定的营养成分，来自集 约化畜牧业的颗粒状动物粪便最近被推荐用作化学氮 肥的替代品，以减少氮输入和硝酸盐浸出（Bouwman） 等。2002;Velthof等。2003)。然而，有机肥料的施用 刺激了土壤中N2O的产生。例如，在施用沉淀的家禽粪 便后观察到来自旱田土壤的大N2O排放（Hayakawa等人。

2009）或猪粪（秋山和鹤田2003)。

微生物硝化和反硝化是N2O生产和排放中最重要的过

程

来自农业土壤。硝化作用是一种好氧氨氧化过程，其中N2O作为副产物产生（Bremner和Blackmer）1978).反硝化是一种厌氧微生物呼吸过程，其中硝酸盐/亚硝酸盐逐步减少为气态产物

反 应 ：NO minus;→NO minus;→NO→NO→N （Hayatsu 等

材料和方法

土壤样品和颗粒状家禽粪便

从表层（0-10厘米）收集土壤样本

3 2 2 2

人。 国家农业研究所的实验场

2008).当硝酸盐/亚硝酸盐还原为N2 气体在土壤中不完全时，产生N2O作为中间产物。施用颗粒状家禽粪便产生的N2O排放主要通过反硝化作用产生（Hayakawa等。2009).

减缓耕地土壤氮2O排放对于扭转全球气候变化至关 重要（Spiro2012;汤姆森等人。2012).已经报道了使 用硝化抑制剂如3,4-二甲基吡唑磷酸盐和双氰胺与施 肥相结合作为减少土壤中N2O排放的有效方法（Dittert 等。2001;Macadam等人。2003;Ma等人。2013).但是， 这对农民来说是不切实际的，因为额外的费用会很大。作为替代方案，Richardson等人。（2009）表明细菌

N2O还原酶的生化特性可用于N2O的消耗。此外，通过引 入具有增强的N2O-还原活性的共生的Bradyrhizobium菌 株，成功地减轻了大豆根际的采后N2O排放（Itakura等。2013).

我们以前通过单细胞分离方法从稻田土壤中分离出一些活性反硝化细菌（ Tago et al。2011; 西泽等人。

2013).虽然绝大多数分离株同时产生N2O和N2 作为反硝化的最终产物，但是几种菌株在所用条件下仅产生N2

（Tago等人。2011).此外，我们从稻田土壤中鉴定并分离了几种活性N2O-还原菌株（Ishii等。2011).我们假设施用沉淀的家禽粪便后N2O-产生的反硝化作用可以通过用这些菌株接种颗粒而转向N2 产生，从而减轻N2O 的排放。为了证实该假设的有效性，在该研究中进行了以下实验室实验：（1）将沉淀的家禽粪接种N2生成的反硝化细菌，然后培养;（2）当N2O排放活跃（接种中期）时，在沉淀期间，用颗粒状家禽粪肥施肥的土壤接种N2生成的反硝化细菌;（3）在培养期开始时（初始土壤接种），用颗粒状家禽粪肥施肥的土壤接种N2生成的反硝化细菌;（4）颗粒状家禽粪便首先接种N2生成的反硝化细菌，然后在培养开始时与土壤混合（初始颗粒接种）。

环境科学，日本筑波（北纬36°01，东经140°07）。土壤取样于2011年4月进行，当时田地处于休耕期。土壤为Eutric Fluvisol（灰色低地土壤），pH值（H2O） 为5.68，总C和N含量分别为17.0和1.3 mg kgminus;1，土壤质地为

50.2 ％的沙子， 23.2 ％的淤泥和 26.6 ％的粘土

（Akiyama等人。2013).将土壤样品通过2mm筛网过筛并在4℃下在黑暗中储存直至使用。在该研究中使用市售的颗粒状家禽粪肥。Hayakawa等人先前已描述了沉淀粪肥的化学性质和聚集体尺寸。（2009).

N2 - 生成和N2O-还原反硝化细菌菌株

从日本各种稻田和稻田 - 大豆轮作田土壤中分离出

110株候选的反硝化菌株（Tago等。2011).反硝化最终产物（N2O N2）中N2 的比例在候选菌株中不同，范围从0 到100％（ Tago 等。2011). 其中， 7 个N2 生成菌株

（ N2/（ N2O N2 ）= 100 ％）用于本研究（ Azoarcus sp.KH32C ， KS11B 和KS30A; Niastella ） sp.KS31B; Dechloromonas sp.KS31F; Dyella sp.YH11B和YS9C）。对于这七种菌株，证实了减少外源N2O的能力。简而言之， 将每个菌株接种到5ml稀释的营养肉汤中，所述营养肉 汤在10ml玻璃血清瓶（Nichiden-Rika Glass，Kobe，

Japan）中补充有4.4mM琥珀酸盐，顶空中的空气用氩气 的混合物代替。和N2O（95：5）。在30℃温育1周后，通 过配备有电子捕获检测器（ECD-GC，Shimadzu GC-2014， Shimadzu Corp.，Kyoto，Japan）的气相色谱法测量N2O 发射量。除了这7个N2生成菌株外，还有一株N2O-还原反硝化细菌Burkholderia sp。TSO47-3，已从稻田土壤中分离出来（Ishii等。2011）被使用了。菌株TSO47-3显示出强的N2O-还原活性，但是来自NO3minus; 和NO2minus; 的反硝化 活性相当弱（Ishii等。2011).每种菌株在琼脂平板上 厌氧生长， 所述琼脂平板用补充有0.3mM 硝酸钠和

4.4mM琥珀酸钠的稀释营养肉汤制成（Nishizawa等人。

2012） 在

26°C，持续2周。挑取琼脂平板上的菌落，重悬于无菌蒸馏水中，并通过离心/重悬浮洗涤。将得到的细胞悬浮液用无菌蒸馏水稀释至光密度为1.0,600nm。

孵化用去离子细菌接种的颗粒状家禽粪便

将完整的颗粒状家禽粪便（1.5g）置于50ml玻璃血清 小瓶（Nichiden-Rika Glass，Kobe，Japan）中，并接种100mu;l该菌株的细胞悬浮液（约108 细胞）。检查。作为对照，加入100mu;l无菌蒸馏水代替细胞悬浮液。 作为另一个对照，将1.5g研磨的沉淀粪肥置于小瓶中， 并加入100mu;l无菌蒸馏水。将小瓶用丁基橡胶塞密封， 并在30℃下温育5天。孵育后，使用玻璃注射器取出顶 空气体样品（1.0ml或100mu;l），并使用ECD-GC测量N2O。每种菌株或处理有三次重复。进行双侧，未配对的学 生t检验以进行统计分析。

中期接种土壤微观世界实验

对于每个土壤微观世界，将100g（作为烘干土壤）的土壤与1g沉淀的家禽粪肥混合并充分混合。将土壤含水量调节至最大持水量（MWHC）的60％。将每种土壤

- 肥料混合物置于玻璃瓶（500ml）中，该玻璃瓶用具 有若干小孔（lt;5mm）的铝箔覆盖，然后在27℃下温育。在培养期间，通过每2或3天添加无菌蒸馏水将土壤水 含量保持在MWHC的60％。培养开始后12天，当N2O通量 接近其最大值时，用1mL Niastella sp的细胞悬浮液接种土壤 - 肥料混合物。KS31B，Burkholderia sp。TSO47-3，Azoarcus sp。KS11B，或Azoarcus sp。如上所述制备KH32C并完全混合。使用这四种菌株是因为 它们显示出在沉淀的家禽粪便孵育实验中减轻N2O排放 的显着能力。接种后，以与以前相同的方式进一步培 养土壤肥料混合物。为了测量N2O通量，使用玻璃注射 器从瓶子中取样100mu;l或1.0ml顶空气体，然后通过带

均匀。对于颗粒接种，在与土壤混合之前，将1g沉淀的家禽粪肥接种100mu;l细菌悬浮液。如上所述进行土壤 - 肥料混合物的孵育和N2O通量的测定。每种菌株或处理有三次重复。

结果和讨论

N2O由颗粒状家禽粪便生产

在该研究中使用的七种N2生成菌株中的每一种都在具有外源N2O的玻璃血清小瓶中培养;孵育期后，每个小瓶的顶空中残留少于10％的初始N2O（数据未显示），表明超过90％的N2O已被还原为N2 。因此，所有7个菌株都显示出将外源N2O还原为N2的能力。

将完整沉淀的家禽粪便孵育5天后，在未接种的玻璃小瓶顶部空间中检测到的N2O比接种的小瓶的顶部空间中检测到的更多N2O（表1).相反，当在没有接种的情况下孵育研粒时，检测到更少的N2O.这些结果表明，来自完整沉淀的家禽粪便的N2O可以通过在表面好氧位点硝化后在沉淀粪肥内的厌氧位点进行反硝化而产生。从地面沉淀粪便中减少N2O排放的原因可能是因为这些厌氧地点大部分被淘汰。这些结果与在实验室土壤微观世界研究中获得的结果一致，其中土壤用完整或磨碎的家禽颗粒肥料施肥（Hayakawa等。2009).

表1接种N2生成反硝化细菌的颗粒家禽粪便产生N2O

接种菌株 N2O代，mu;gN/ g颗粒（SD）

有硅隔膜的塑料盖将瓶盖关闭1小时，然后进行ECD-

GC分析。每种菌株或处理有三次重复。初步接种土壤微观世界实验

如上所述建立土壤微观世界并接种Niastella sp 。

KS31B，Burkholderia sp。TSO47-3，或Azoarcus sp。

KS11B，已被证明

Azoarcus sp。KH32C 7.5times;10 minus;2 (12.3times;10 minus;2)*

Azoarcus sp。KS11B 3.7times;10 minus;2 (2.7times;10 minus;2)*

Azoarcus sp。KS30A lt;24.7times;10 minus;2*

Niastella sp。KS31B lt;4.3times;10^minus;2* Dechloromonas sp。KS31F 71.6times;10^minus;2 （3.0times; 10^minus;2）* Burkholderia sp。TSO47-3 2.9times;10^minus;2 （2.0

times;10^minus;2）* Dyella sp。YH11B 74.3times;10 minus;2 (32.0times;10 minus;2)

Dyella sp。YS9C 19.7times;10 minus;2 (4.8times;10 minus;2)*

没有接种 83.4times;10 minus;2 (17.3times;10 minus;2)

显着减轻接种中土壤中的N2O通量

微观世界实验。接种以两种不同的方式进行：土壤接种和颗粒接种。对于

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