在植物RNAi株系中，一步法、零背景不依赖于连接克隆的含内含子的发夹RNA结构外文翻译资料

在植物RNAi株系中，一步法、零背景不依赖于连接克隆的含内含子的发夹RNA结构

原文作者

Guoyong Xu*, Ning Sui*, Yang Tang, Ke Xie, Yizhen Lai and Yule Liu

单位

Protein Science Laboratory of Ministry of Education, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China

摘要

bull;在植物基因功能的探索中，发夹型RNA干扰技术起着重要的作用。虽然有几种制造发夹RNA（hpRNA）结构的方法，但这些方法通常需要多个比较费力、费时、成本高的克隆步骤。在这里，我们描述了一个用载体pRNAi-LIC，构建内含子发夹结构RNA（ihpRNA）的方法，即OZ-LIC法(One-step, zero-background ligation-independent cloning)。

bull;为了生成零背景的ihpRNA结构，这个方法只需要处理靶基因的两种PCR产物，该靶基因两侧有不同的LIC序列和线性SmaI的pRNAi-LIC载体，然后用 T4 DNA聚合酶分别将这些处理的基因，然后转化大肠杆菌。

bull;有OZ-LIC RNAi载体形成的ihpRNA结构不仅能有效地诱导产生使外源标记基因和内源性耐药相关烟草SGT1基因的短暂沉默，而且能诱导产生使拟南芥SGT1b基因稳定沉默。

bull;该新OZ-LIC方法和RNAi载体在植物基因敲除方面将是一个强大的工具，并且能促进植物基因功能的高通量测定。

引言

随着基因序列的爆炸性释放，为了将这个序列信息转换成功能信息，已经开发了大规模的方法。研究T-DNA和在转座子基础上插入突变体的人群 (AzpirozLeehan amp; Feldmann, 1997; Martienssen, 1998;Kumar amp; Hirochika, 2001; Alonso 等, 2003)提供了基因功能分析的相关资源。然而，因为基因靶向的偏差，表型的缺乏或插入的丢失导致死亡，所以这些方法不能破坏或瞄准所有基因，即使在模式植物拟南芥中。大多数植物基因的功能尚不清楚。

自利用RNAi干扰发现了双链RNA（dsRNA） (Fire 等, 1998)，双链RNAi已被广泛应用于下调各种生物的基因表达，在基因功能分析方面已成为一个最强大的工具。最近，人工的microRNA（即微小RNA）技术也已经出现，在植物中阻断基因的表达(Niu等, 2006;Schwab 等, 2006; Ossowski 等, 2008)。植物RNA干扰的一个常见方法是使用载体产生含有ihpRNA的结构，如使用发夹序列功能的内含子具有最高的转录后基因沉默（PTGS）效率（Smith 等，2000）。传统的基于连接酶的载体最早用于生成ihpRNA结构(Smith 等, 2000)。基于这些载体的这个方法通常需要使用几次限制酶消化法和连接，因此是费力的，只能适用于小规模。除了传统的连接酶载体，基于RNAi载体的Gateway克隆系统在ihpRNA的构建中发挥了重要作用(Wesley 等, 2001)。基于载体的GATEWAY ihpRNA载体克隆法克隆的目的基因的PCR产物两侧attB1 和 attB2 序列为供体载体(如 pDONR207)，由GATEWAY BP反应生成一个中间载体，然后GATEWAY LR反应使克隆的目的基因片段到GATEWAY目的载体。因此，它通常需要两克隆步骤生成最终的ihpRNA结构。此外，基于载体的GATEWAY法ihpRNA载体克隆往往在反义方向产生意想不到的重组产品，这些重组产品伴随着相对于启动子来说功能丢失的内含子(Helliwell 等, 2002; Helliwell amp; Waterhouse, 2003）。然而，在GATEWAY系统中使用的酶的成本是比较高的，特别是在发展中国家的研究人员。最近，一些基于PCR的方法被开发来生成ihpRNA盒。据报道，DA-ihpRNA方法使用靶基因的内含子去产生的ihpRNA盒(Xiao 等, 2006)。这种方法需要从含内含子基因组DNA来放大的ihpRNA盒，虽然这种方法简单、快速，但是具有靶片段区域的限制，还需要更多的传统的克隆步骤插入ihpRNA盒到最终的载体中。这个方法不适合构建ihpRNA内含子的基因或仅表达序列标签（EST）序列的基因。最近，使用ZeBaTA载体（Chen 等, 2009），和茎环hpRNA结构的一步构建hpRNA的方法，是通过三个PCR片段重叠获得的，包括两个反向重复序列的靶基因和环片段。然而，用内含子当做间隔需要更多的时间确定内含子的方向，并提取正确的克隆，以达到最高的沉默效率。混合重叠延伸PCR方法已报道产生hpRNA盒但它需要两更传统的克隆步骤生成最终的构建（Yan 等, 2009）。更重要的是，所有这些基于PCR的方法参与全长hpRNA盒PCR扩增，包括两个反向重复序列的靶基因。这种重叠PCR常常很困难，因为PCR的抑制作用来自两个反向重复序列自身退火(Broude 等, 2001)。因此，所有可用的ihpRNA构建方法都有一定的局限性。

为了研发一种简单快速的克隆载体去构建RNAi，我们采用改良连接独立克隆（LIC）(Aslanidis amp; de Jong, 1990; Hsiao, 1993; Aslanidis 等, 1994; Palauqui 等, 1996; Dieckman 等, 2002; Dong 等, 2007)的方法。LIC策略依赖于T4 DNA聚合酶的核酸外切酶活性，在DNA片段的两端产生相当长（gt; 12 nt）的粘性末端。这些长长的粘性末端以定向的方式允许一个到燕尾榫多个DNA片段。得到的杂种可以转化成没有先验切口修复的大肠杆菌，这种修复是需要DNA连接酶的。连接独立克隆比其他克隆策略更快和更准确，因为它只需要一个单一的改造，并已用于构建基于病毒的诱导基因沉（VIGS）默的烟草花叶病毒(Dong 等, 2007)。在这里，我们描述了一个快速、一步和零背景LIC（OZ- LIC）的方法，通过我们新的植物RNAi载体pRNAi-LIC来构建ihpRNA，使我们可以绕过传统的局限性和连接酶使用，很容易地构建植物RNA沉默的一步法转化酶切位点。我们已经成功地应用这种方法构建了10个茎从300 bp至700 bp长度的ihpRNA，并取得了100%的阳性克隆效率。此外，我们的ihpRNA结构产生的载体能有效诱导短暂沉默和稳定的转基因抑制。这些结果表明，在植物研究的促进高通量功能基因研究中，我们构建ihpRNA的OZ-LIC方法是可靠的和可重复的。

材料与方法

植物和质粒材料

转基因烟草植物中含N基因和TMV-GFP（GFP标记的烟草花叶病毒），用于抗TMV分析（Liu 等, 2002a）。拟南芥Col-0生态型用于植物转化。野生型基因用于其他的功能分析。pYL41是基于pCAMBIA2300的T-DNA载体，该载体包含重复的CaMV 35S启动子和NOS终止子pyl44（Dong 等, 2007）；pSAH18是含有ccdB基因的质粒，ccdB基因在不改变氨基酸序列的基础上利用相应的酶切位点进行切除(A.H. Sha and Y.L. Liu, unpublished)。

植物RNAi载体pRNAi-LIC

pRNAi-LIC载体是以为pYL41为骨架产生的。首先，利用pSAH18作为模板扩增 ccdB基因，引物为5rsquo;-CC gagctc TAG AGC ACA CGA ccc ggg CTG TGT ATA AGG GAG C-3rsquo; (5rsquo;-SacI-LIC4- SmaI-ccdB-3rsquo;) and 5rsquo;-CGG ggtacc GGG CCC TGA GGA GAA GAG ccc ggg AAT TCT CGA CTA AGT-3rsquo; (5rsquo;-KpnI-LIC2-SmaI -ccdB-3rsquo;)，用SacI和KpnI消化，再克隆到载体pYL41中生成pYL41- ccdB。第二，用pHellsgate (Wesley 等, 2001)作为模板，将含有氯霉素抗性基因的内含子进行PCR扩增，引物为5rsquo;-CGG ggatcc gagctc GAC GAC AAG Acc cgg gTT CCG TGC TGG AAc caa CTG TAA TCA ATC CAA ATG (5rsquo;-BamHI- SacI-LIC1-SmaI-LIC3c-Pdk intron-3rsquo;) 和5rsquo;-CGG gggccc ttg GTA AGG AAA TAA TTA TTT TCT TTT TTC C-3rsquo; (5rsquo;-ApaI-Pdk intron-3rsquo;) ，然后再克隆到T载体pEASY-T1(Transgene, Beijing, China)中产生pPDK。在pPDK中有两个ApaI位点（一个通过引物，另一个在载体pEASY-T1中）。最后，pPDK中的PDK内含子片段连接到pYL41-ccdB中的ApaI位点产生pRNAi-LIC。pRNAi-LIC被用来为本文中所涉及到的沉默基因构建所有的ihpRNA结构，并保留在ccdB基因不会致死大肠杆菌DB3.1中。全长序列和 pRNAi-LIC的详细注释被存放在GeneBank（登录号是gq870263；在ABRC的文件名称是pRNAi-LIC）。

构建ihpRNA的连接独立克隆程序

为了给沉默基因构建ihpRNA，相同的目标区域由不同的基因扩增两次。通过第一个低聚对进行的第一种PCR产物的扩增：5rsquo;-CGA CGA CAA GAC CCT基因的特异性上游引物和5rsquo;-GAG GAG AAG AGC CCT基因的特异性反向引物3rsquo;（划线的序列与LIC1和LIC2分别相配），被叫做“PCR产物1”。第二种PCR产物被称为“PCR产物2”，这种PCR产物利用纯化后的PCR产物1为模板和通用低聚对LIC3-TT- LIC2 (5rsquo;-CCA GCA CGG AAC CCT TGA GGA GAA GAG CCC T-3rsquo;)和LIC4-TT-LIC1 (5rsquo;-AGA GCA CAC GAC CCT TCG ACG ACA AGA CCC T-3rsquo;) （划线的序列与LIC3和LIC4分别相配），其中退火PCR产物1末端序列的退火是各自进行的。另外，为了节省时间，对同一目标区域的PCR产物2通过第三中低聚对进行扩增：5rsquo;- LIC3-TT基因的特异性反向引物3rsquo;和5rsquo;-LIC4-TT- gene基因的上游引物primer-3rsquo;。PCR产物用前面的聚乙二醇（PEG）-MgCl₂沉淀进行纯化（Dong 等, 2007），或用凝胶纯化试剂盒的情况下，在PCR产物中有除目的片段的非特异条带。在22°C、1bull;反应缓冲液和5毫摩尔的情况下，50ng的PCR产物1和和PCR产物2的样品分别用0.5个单位的T4 DNA聚合酶处理30分钟（Fermentas, Beijing, China），T4 DNA聚合酶用75℃处理20分钟后失活。pRNAi-LIC载体经SmaI消化，并且和T4 DNA聚合酶进行同样的处理，但是用dTTP代替dATP。将处理后50ng的PCR产物1和PCR产物2的样品和处理后的pRNAi-LIC载体混合，在22℃下培育 15-30分钟。然后将混合物转化大肠杆菌DH5a的感受态细胞中(Tiangen, Beijing, China)，用含卡那霉素的 Luria-Bertani (LB)培养基筛选重组子。

基因沉默载体

产生了如前面所述的沉默基因GFP，GUS，NbSGT1 和 AtSGT1b的ihpRNA结构，分别命名为pRNAi-GFP，pRNAi-GUS，pRNAi-NbSGT1 和 pRNAi-AtSGT1b。常用来产生PCR产物1和产生PCR产物2来构建ihpRNA的PCR引物是OX1 和 OX2 (为 GFP; AF007834)， OX3 以及 OX4 (为GUS; AY292368)，OX5 and OX6 (为NbSGT1; AY899199), 还有 OX7 和 OX8 (为 AtSGT1b;At4g11260)。其他六个基因的沉默载体用同样的方法产生，这六个基因包括拟南芥TIR-NBS-LRR 类蛋白基因（AtTNL; At4g19520），烟草类ERD2基因NbERD2a（GU388433）和NbERD2b（GU388432），棉花类MSH1基因（GhMSH1; TC16563）和ORSV外壳蛋白基因（ORSV-CP; EU683879）和建兰花叶病毒（CyMV-CP; FJ858205

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