重组抗蛇毒血清 ——一项在用于治疗易被忽视的热带疾病中具有成本竞争优势的方案外文翻译资料

重组抗蛇毒血清

——一项在用于治疗易被忽视的热带疾病中具有成本竞争优势的方案

原文作者：Andreas H. Laustsen, Kristoffer H. Johansen, Mikael Engmark, Mikael R. Andersen

单位：丹麦技术大学生物技术和生物医学系，丹麦；

丹麦技术大学，国家兽医学院，丹麦；
丹麦技术大学生物与健康信息学系，丹麦。

摘要： 毒蛇咬伤是热带地区发展中国家主要的公众健康困扰。在撒哈拉沙漠以南的非洲，人们的忽视导致了抗蛇毒血清的缺乏，这危及着蛇毒受害者的生命和肢体。抗蛇毒血清的技术进步是必要的，但不仅要评估其可能的治疗效果，还要评估其成本竞争力。以CHO细胞培养所产生的人类IgG抗体寡克隆混合物为基础的重组抗蛇毒血清可能是获得更好蛇毒治疗的关键。根据行业数据，用重组抗蛇毒血清治疗毒蛇咬伤的治疗费用估计为60-250美元，用于最终的药物产品。据报道，目前市场上的一种有效的抗蛇毒血清(来自南非疫苗生产商的多价抗蛇毒血清)，治疗蛇咬伤每疗程的平均市场价为640美元。因此，重组抗蛇毒血清在未来可能会成为现有基于免疫血清的抗蛇毒血清成本竞争的替代品。

作者简述：

鉴于在撒哈拉以南的非洲，毒蛇咬伤的药物重要性以及目前抗蛇毒血清的短缺，需要在抗蛇毒开发和生产方面取得技术进步。可以采取的途径之一是使用基于人类IgG抗体的寡克隆混合物的重组抗蛇毒血清，因为这些抗体可能具有与人体免疫系统相适应的优势，而且它们的生产在动物免疫系统和毒液获取方面是独立的。然而，向诊所引进重组抗蛇毒血清的一个关键问题是它们的生产成本，因为毒蛇咬伤的受害者往往是生活在热带地区发展中国家偏远地区的贫穷的农村工人。在此，我们的目标是提供重组抗蛇毒血清制备的成本估计，特别关注撒哈拉以南非洲地区的蛇咬伤。我们的研究结果表明，与现有的基于动物的抗蛇毒血清相比，在未来重组抗蛇毒血清确实具有成本竞争力。此外，我们还概述了不同的生产策略，并建议使用辛酸沉淀作为一种低成本的纯化方法，随后由于在目前抗蛇毒制备中使用需要培养CHO细胞用于抗体表达。

引言：

在全球有大量被毒蛇咬伤引起的疾病负担，尤其影响非洲、亚洲、大洋洲和拉丁美洲的贫穷的农村地区。毒蛇咬伤的发生率估计为每年2-3百万次，造成10万多人死亡。虽然动物衍生的抗血清仍然是蛇咬伤治疗的基石，但生物技术的进步推动了基于人类或新型骆驼抗体支架的不同的抗蛇毒血清的出现，这可能为未来重组抗蛇毒抗体的寡克隆混合物铺平道路。重组抗蛇毒血清用于治疗蛇毒的潜在好处包括，由于可能产生完全针对医学相关蛇毒毒素的全人类抗体的可能性(血清疾病和过敏反应在动物衍生的抗血清中并不罕见)，因此具有更高的效力和更少的副作用。在血清型抗蛇毒血清的生产中，针对蛇毒毒素的治疗相关抗体不能很容易地与针对其他目标的治疗无关的抗体分离(例如，免疫动物在其生命中遇到的细菌或病毒)。相比之下，重组抗蛇毒血清可以产生比目前血清型抗蛇毒血清显著更高的治疗活性抗体浓度，已知仅含有5-36%的针对毒液成分的特异性抗体。然而，在发展中国家贫穷的农村地区，抗蛇毒抗体混合物的生产缺乏成本竞争的生产仍然是一个关键的障碍。

有毒蛇的四科(眼镜蛇科、毒蜥科、马齿苋科和科鲁布里科)，其中的眼镜蛇(如眼镜蛇、眼镜蛇和珊瑚蛇)和蝰蛇(如响尾蛇和其他蝮蛇)对绝大多数毒液都有责任[12]。在有毒的四科蛇类(眼镜蛇科、蝰科、穴蝰科和游蛇科)，其中的眼镜蛇(如眼镜蛇、巴曼蛇和珊瑚蛇)和蝰蛇(如响尾蛇和其他毒蛇)是对绝大多数毒蛇伤的原由。一般来说，蝰蛇毒是细胞毒性、血毒性、偶有肌肉毒性的，而眼镜蛇毒液主要引起全身的神经毒性。蝰蛇和眼镜蛇的临床表现不同于蛇毒中的毒素作用部位不同。此外，一些毒液毒素相互独立，而对另一些毒素则通过毒素协同作用增强毒性。神经毒素必须先通过体循环，才能到达中枢神经系统的相关靶点，因此通常剂量很小。相反，引起组织损伤的毒素，包括蛋白酶、细胞毒素和肌毒素，是更大的蛋白质，主要在叮咬处发挥其破坏性作用。不同毒素的作用位点的不同意味着反毒液对抗局部作用的毒素需要能够到达远端部位和深层组织，而循环系统中的快速分布足以有效地提供抗毒性的抗蛇毒血清。

目前,动物蛇咬伤抗蛇毒血清都是以三重不同的生产结构方式:IgG-based,基于F(ab)2,Fab-based(见图1)。F(ab)2和基于fab2的是通过在生产过程中使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，通过去除动物源IgG抗体的Fc区域，从而产生改善的安全性。与IgG-based 抗蛇毒血清相比，Fab-based的抗蛇毒血清能更好地达到和中和毒素，但它的代价是降低血清半衰期。相比之下，F(ab)2-based抗蛇毒血清的药代动力学性质介于 IgG-based 抗蛇毒血清和 Fab-based 抗蛇毒血清之间。

因此，不同的抗蛇毒血清有不同的优点和缺点。IgG格式可能是针对具有系统作用的毒素的一个更理想的解决方案，而Fab格式可能更适合于对抗局部作用的毒素。其他形式的研究，包括单链可变片段(scFv)和新型骆驼单域抗体(VHH片段)，但这些都还没有在临床试验中得到验证。

免疫动物血浆中IgGs纯化的标准方法是基于辛酸沉淀。这种方法既便宜又坚固，而且在最终产品中也留下了不需要的辛酸。为了提高抗蛇毒血清的纯度，可以采用额外的色谱步骤，虽然这导致产量降低和生产成本的明显提高。来自血浆的IgGs的辛酸沉淀与重组mAb生产相比较，其中标准纯化方法基于使用蛋白A捕获的亲和层析。蛋白质A色谱法的优势在于它可以生成更纯的产品。然而，这种方法也要昂贵得多，而用于抗体亲和力结合的树脂的使用数量有限[17,18]，通常是150-200个(与 Anne Tolstrup, Biogen (Denmark) A/S个人讨论)。

为了大规模生产单克隆重组抗体，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达系统最为常见，部分原因是它们能够产生与人类模式相似的糖基化模式。CHO细胞的表达传统上是在fed-batch过程中进行的(见图2)，在这个过程中，CHO细胞的营养物质被提供给一个完整的生产过程，然后是整个批次的收获。然后用一个或多个色谱纯化步骤来提纯这些抗体。其他成本竞争的生产过程，例如混合和连续灌注过程(见图2)形成。在混合过程中，培养是在非间歇反应器中进行的，然后是连续的或半连续的纯化产生的抗体。在连续灌注过程中，培养的细胞被保留，而含有抗体的生长介质在灌注反应器中不断被新鲜培养基取代。所使用的培养基进行连续或半连续的纯化过程，以分离抗体(见图2)。在连续灌注过程中，该行业的几家公司采用了连续的色谱方法，如模拟移动床层色谱(SMBC)(与Mads Laustsen个人讨论，Symphogen A/S)。 这种方法可以有效地利用色谱介质，同时也能提高纯化产物的产量。在这里提供的工作中，我们以SMBC为下游工序的混合和连续灌注过程的计算为基础。此外，我们将这些计算的结果与生产设置进行比较，在这种情况下，混合和连续的过程采用了辛酸沉淀作为净化方法，因为这一下游工序是一种成本竞争的替代方法，已经在现有的抗蛇毒产品中使用。

在以后的几年里，人们对产生单克隆抗体混合物越来越感兴趣，这是基于一种期望，即通过针对多个不同适应症中的多个目标，可以获得改进的抗体疗法。可以使用两种不同的策略来产生这种抗体混合物:1)单独生产的单克隆抗体的平行批次(图3A)和2)单个批次中抗体的寡克隆表达(图3B)，以Merus Oligoclonics技术和Symphogen的Sympress技术为例。在低克隆技术中，单个细胞系通过一个共享的轻链和2-3个不同的重链进行转染，产生几种不同的特异性。在Sympress技术中，每个表达不同抗体的克隆细胞系在单个批次中混合在一起，以产生理想数量的特异性抗体。随着单细胞线表达系统的出现，不同类型的单细胞表达系统在不同的重链中产生了稳定性的挑战，从而限制了不同的特异性。另一方面，由于每一种抗体的特异性是由单独的细胞株产生的，而另一方面的Sympress技术可以提供多种不同的特异性。

鉴于蛇毒的复杂性，单一单克隆抗体不太可能有效地中和蛇毒，因为蛇毒中含有大量不同蛋白质家族的毒素。相反，抗体的混合物将被需要，以中和大部分医学相关的蛇毒毒素。此外，人们希望有多价的抗蛇毒血清，它的目标不仅仅是单一的蛇类，因为它不可能让临床医生明确地识别出蛇的种类。因此，如果要引进重组抗蛇毒血清，就需要有一种明确的技术支持，以便能够使低克隆抗体混合物产生具有成本竞争力的生产。关于重组抗蛇毒血清的概念研究的实际证明从未被报道过。然而，抗体表达和CHO细胞培养相关领域的充分知识存在，以评估未来重组抗毒液的效用和成本竞争力。在此，我们提供了基于行业数据的寡克隆重组抗蛇毒血清的生产成本估算，并讨论了新型抗体表达技术对未来蛇毒治疗的影响。抗蛇毒药物的生产可能是为了能够中和世界上特定地区的大部分医学相关蛇咬伤，但不是整个世界。因此，我们将目前的估计数据基于一种假想的多价抗蛇毒血清，可用于治疗撒哈拉以南非洲地区每年发生的约100万次蛇毒污染，因为这种来自动物血清的泛非抗蛇毒血清已经存在用于比较。

方法

估计撒哈拉以南非洲抗蛇毒血清中治疗活性抗体的最低需求量

对于确定重组抗蛇毒血清的最大生产成本来说，估计对活性抗体（活性药物成分，API）最小需求以中和毒蛇咬伤是至关重要的，因为该成本高度依赖于生产规模。在此，对活性抗体的最低限度需求是基于撒哈拉以南非洲地区毒蛇咬伤的数量（大约一百万名受害者），需要治疗一次毒蛇咬伤的平均小瓶数量（代表SATMR蛇多价 来自南非疫苗生产商的抗蛇毒素）估计每个处理6至10瓶，该抗蛇毒血清的体积和蛋白质含量（10mL和172mg / mL）（通过其在280nm处的吸光度 NanoDrop 2000c仪器，Thermo Scientific），以及抗蛇毒血清中识别抗体的百分比的最低估计值（5％）（5％至36％）。事实上，治疗活性抗体的数量可能会更低，因为并非所有的毒液成分都与医学相关，但在动物免疫过程中仍然会引起免疫反应。同时，我们假设产生的抗体与当前抗毒液中发现的治疗活性抗体的作用是相同的(molto -mol / mol)，我们在计算抗体的最小需要时，将IgG分子和F(ab)2片段之间的分子量差异计算在内。最后，我们没有考虑到任何数量的抗蛇毒，可能会因为过期而被丢弃。

生产单克隆抗体的产品成本（COGM）/克

重组单克隆抗体的成本高度依赖于生产方法和生产规模。摘要对活性药物成分(COGMAPI)制造的产品成本进行了广泛的分析。单克隆抗体的生产成本从36美元/g到1500美元/g不等，具体取决于所使用的生产设施和开发过程(与Anne Tolstrup, Biogen(丹麦)A/S个人讨论)。 我们将我们的计算基于Sympress技术，因为这已成功用于开发和生产几种基于单克隆抗体单克隆抗体的疗法，这些疗法已进入临床试验（http：//www.symphogen.com / pipeline）。估计重组单克隆抗体的COGMAPI比常规mAb的生产成本高0-10％。在我们的分析中，基于补料分批，杂交和连续灌流过程的报告成本估算，我们采用了四种生产情况（年产100kgAPI，200kgAPI，500kgAPI和1,000kgAPI）来估计产生单克隆抗体单克隆抗体的COGMAPI。所报告的成本估算是基于SMBC作为纯化过程，使用补料分批，混合和连续灌流的最现实的假设进行计算，其中补料分批反应器多次使用以获得3 g / L的滴度， 并且在连续灌注的情况下，以每细胞1个细胞滴定度为0.4nL的细胞特异性灌注速率（CSPR）为0.05nL进行连续灌注，滴度为0.4g / L。

用于单克隆重组抗原的每种治疗的制造成本（COGM）

为了评估使用寡克隆重组体抗蛇毒血清以500kgAPI规模进行蛇毒治疗的COGMAPI，直接成本为62美元/克（补料分批），47美元/克（混合）和89美元/克（连续灌流）（ 在前一节中确定）被采用（也参见图4）。估计值基于目前抗蛇毒血清中存在的两种不同的相对量（5％和20％）的治疗活性抗体。 来自南非疫苗生产商的南非非洲医学研究所蛇多价抗蛇毒血清研究所的平均治疗瓶数量基于2003年公布的数据。小瓶体积和蛋白质浓度与上面给出的相同。最后，为了估算最终药品的制造成本（COGMFDP），制剂和包装的成本（与Mads Laustsen，Symphogen A / S讨论）估计为5美元/瓶，这是当前报道的抗蛇毒血清成本的五倍，并且将含有重组寡克隆抗蛇毒血清的10mL小瓶中的活性抗体浓度的上限设定为100mg / mL。为了进行比较，我们基于用于生产寡克隆重组抗体的替代数据集进行了成本估算，其使用辛酸沉淀作为500kgAPI规模的杂交和连续灌注过程的纯化方法。在这里，我们应用COGMAPI进行商业化生产，并添加了10％的寡克隆生产：补料分批培养后为46美元/克，接着是单批次色谱，杂交后为33美元/克（补料分批培养，然后是连续沉淀为基础的纯化） ，42美元/克连续灌注，然后连续沉淀纯化。

结果与讨论

撒哈拉以南非洲地区最需要抗蛇毒血清药物

重组抗体生产的单位成本高度依赖于所产生抗体的规模。 为了估计治疗撒哈拉以南非洲所有蛇伤所需的抗体数量级，我们忽视了这样一个事实，即许多抗蛇毒血清可能不能用于有效的治疗，因为在供应链中过期或失效。因此，我们假设制造量等于需求，但实际情况可能并非如此。 此外，我们仅考虑了当前抗蛇毒血清中的治疗活性抗体，其可能不超过抗蛇毒血清中能够识别蛇毒素的抗体的量：5％至3

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