巴西矛头蝮卵源性抗蛇毒血清IgY的研制外文翻译资料

巴西矛头蝮卵源性抗蛇毒血清IgY的研制

原文作者 A.S. Arauacute; jo , Z.I.P. Lobato ,

C. Chaacute;vez-Oloacute; rtegui, D.T. Velarde

摘要：本研究的目的是设计一种方法通过鸡卵黄生产IgY抗体提高巴西矛头蝮蛇毒的中和能力，确定了水提物制备的最佳分离方法和定义了用巴西矛头蝮抗原免疫母鸡得到卵源性IgY抗体的最佳纯化条件。用蝮蛇属五种不同的矛头蝮蛇毒的毒液免疫一组为九个单冠的白来航蛋鸡。免疫过程开展三个周期，每次相隔六周。提取卵黄用蒸馏水1:10进行稀释，调节PH为5.0，经过冻融循环，用20%（w/v）硫酸钠盐沉淀再离心，过滤。这种方法能从鸡卵黄中提取2.57 mg/ml IgY。这种制备出来的抗体能有效中和五种矛头蝮中的致病毒素，有效剂量（ED50）为365毫升/2 LD50，1.0 ml的IgY抗体能中和0.154 mg的蛇毒。

关键词：卵源性抗体； IgY抗体； IgY技术； 巴西矛头蝮蛇毒

1. 引言

有毒动物咬伤造成的事故是巴西和全世界的重大问题。2005年，在巴西有96393例事故涉及有毒动物，其中28640例是被毒蛇叮咬所造成的。蝮蛇属则占了84%，死亡率在0.4%左右。这频繁发生的被蝮蛇属咬伤的事故使巴西对于此属蛇的咬伤研究变得非常重要。最广泛接受的治疗方式是使用特异性抗蛇毒血清，从而有效地中和毒液在全身循环。目前使用的抗蛇毒血清是通过有毒动物的毒素减毒后特异性免疫马后产生多克隆抗体，随后用硫酸铵（AMS）的胃蛋白酶处理进行血清提纯。用马作为免疫动物生产抗体的优势和缺点不断被阐明了。然而，在大动物体内生产大量抗血清显然是一个优势。发展中国家在用马生产抗蛇毒血清的过程中由于成本高的局限性，寻求另一种为生产安全和符合成本效益的抗蛇毒血清的动物模型是必要的。山羊和绵羊源性抗蛇毒血清也可能引起早期不良反应和血清病。这些可能对于那些马抗体血清过敏的人比较有用。另一种方法减少不良反应的方式是采用辛酸分离IgG。

鸡卵黄被认为是多克隆抗体的极好来源，可能代表另一种区别于哺乳动物抗体及其产生的问题的替代品。从伦理角度来看，使用鸡生产抗体是很有吸引力的，特别是在三原则的基础上：尽可能地更换、减少和改进实验动物的使用。在避免有些动物的限制和放血去获取抗体的能力有相当大的细化。

鸡免疫球蛋白（抗体）尽管在结构上与哺乳动物IgG存在差异，但是在功能上类似。最初，禽类免疫球蛋白归类于IgG免疫球蛋白，但Leslie and Clem (1969)显示了实验数据证明了两者在结构上的差异，所以提出了IgY的名字。现在，IgY是公认得鸟类、爬行类、两栖类和鱼类的抗体。IgY不结合蛋白A或G蛋白，不与抗体和类风湿因子发生交叉反应，不激活哺乳动物补体反应，不与细胞表面Fc受体结合。所有这些特点在基础研究和应用研究中日益受到重视，包括防龋齿，幽门螺旋杆菌尿素酶的被动免疫，囊性纤维化患者的治疗。

使用IgY对动物毒液的研究始于Talley 和Carroll使用响尾蛇和蝎子。此后不久，Carroll等人研究北美和南美地区的响尾蛇蝮蛇、竹叶青中减毒的毒液。后来， Maya Devi等人使用来自印度的毒蛇毒液。另外一组来自印度的研究小组使用原油和非脱毒锯鳞蝰蛇毒免疫鸡。最近，制备出了对非洲眼镜蛇科和蝰蛇科蛇毒的多价IgY。以前对巴西矛头蝮和响尾蛇属的蛇毒进行研究表明有能中和有毒致病成分抗体的产生。虽然 Sevcik等人表明当IgY作为免疫疗法作用于食用家禽和蛋类食物的人群，会产生不良反应，这些结果促使我们继续对巴西矛头蝮蛇的毒液的禽抗毒蛇血清发展的研究。

本研究的目的是：（a）产生针对于矛头蝮蛇毒的卵源性免疫特异性IgY抗体；（b）确定去除蛋黄脂质去除的最佳工艺和对IgY纯化实验条件下的最佳硫酸铵浓度；（c）确定中和矛头蝮蛇毒致死浓度确定抗体的效价。本报告初步对抗矛头蝮蛇毒鸡卵黄生成做了研究，禽类抗蛇毒血清将作为传统的马抗蛇毒血清的替代。

1. 材料与方法

2.1 蛇毒

根据巴西卫生部建议从成年矛头蝮蛇在使用前进行混合，混合蛇毒分别为：50%巴西具窍蝮蛇、12.5%巴西矛头蝮、12.5%美丽矛头蝮、12.5%矛头天牛、12.5%白尾具窍蝮蛇。

2.2 动物

鸡卵黄中抗蛇毒血清生产丰富，因此采用25周龄的白来航母鸡，重量大概在1600-1800g,均接种禽类常见疾病抗原，保持家禽养殖标准设施提供食物和水供其自由采食。这些是按照巴西政府动物委员会的指示饲养的。小鼠由动物房提供，用于配制毒液毒性和抗蛇毒血清的中和试验，分别表示半数致死量（LD50）和半数有效剂量（ED50）。

2.3免疫计划

将30毫升的矛头蛇毒液与250毫升的0.15 M NaCl和等体积完全弗氏试剂（CFA）混合，然后选用每组九只母鸡，每只母鸡在胸肌处皮下注射四次。第14天，用不完全弗氏试剂（IFA）重复使用相同剂量进行混合。在21天、23天和第25天，每只母鸡接受混合在500毫升0.15 M氯化钠的10毫克的抗原。这是第一个免疫周期；在第八周/第九周和第十四周/第十五周进行了两次加强免疫，每个周期由上述时间表组成，都是以IFA剂量开始。

2.4 鸡卵处理

鸡卵每周收集一次，保存在4 ℃环境中直到加工。后将鸡卵打破，卵黄与卵清进行分离，用超净水清洗。取出膜后，将当天采集的鸡卵中的卵黄全部混合，用0.01%（w/v）叠氮钠保存在4 ℃，直至试验结束。

2.5 卵黄抗体的提取

本研究从三种不同的方法对免疫母鸡卵黄抗体的提取进行了研究：

根据Polson 和 Von Wechmar的方法用五倍PH为7.4的稀释缓冲液、3.5%PEG-8000沉淀。

根据McLaren等人的方法在室温下将羊脂酸（CA）提取，用PH为7.4的PBS进行五倍稀释，缓慢加入CA，直至最终浓度为6%。

根据Kim 和 Nakai的方法，采用水稀释（WD）的方法。简要描述为：卵黄稀释比为1:10，（v/v）与4 ℃蒸馏水，用HCl调节PH为5，然后放在-20 ℃下冷冻、4 ℃下解冻循环一夜。

每种方法的第一步后，所有样品均在800 g下离心40分钟。取上清液通过一个0.45毫米的过滤器。

2.6 IgY的纯化分离

用硫酸铵（AMS）对抗体纯化，再添加在PH为7.4，温度为4 ℃的水溶性成分。另外，样品保持搅拌30分钟再在4 ℃、2000g离心20分钟。得到的沉淀再悬浮在1/10初始量、PH为7.4的PBS中。第二次沉淀周期与最初使用的AMS浓度相同。对PBS进行样品透析储存在4 ℃。这些制剂的纯度检测采用SDS-PAGE；用酶联免疫吸附法检测制剂中的活性，最终产品的中和效果确定用ED50。

2.7 电泳疗法

毒液和抗蛇毒血清样品在7.5%的SDS-PAGE凝胶中采用非还原环境在Ⅱ类设备中检测。样品（20 ml）在浓度为1毫克/毫升的凝胶中电泳，再用考马斯亮蓝染色。

2.8 特异性抗体活性的估计

用ELISA作为检测巴西矛头蝮抗体活性具体活动如下：在96孔的ELISA板上包被0.5毫克/毫升混合蛇毒与50 mM PH为8的Tris-HCl缓冲液100毫升的混合液，在4 ℃下封闭过夜。用混合0.05%的 Tween 20的TBS溶液（TBST）洗涤四次，再配制含有3%脱脂奶粉的TBS溶液100毫升作为封闭液。将板在37 ℃下孵育1 h，再用TBST洗涤四次。将样品三次稀释添加到板中，阳性对照和阴性对照同时平行进行。在37 ℃下培养1 h再洗涤。抗鸡IgY结合碱性磷酸酶（Sigma）用TBS 1:5000稀释再加入板中，37 ℃孵育1 h。用TBST洗涤四次后，底物溶液（对硝基苯磷酸二钠1毫克/毫升（Sigma）在0.1 M PH9.8的缓冲区，二乙醇酰胺）在室温下孵育30分钟，用酶标仪在405 nm处的吸光度下读取。在所有步骤中，板的每一孔都加100毫升试剂。

2.9 老鼠中的抗蛇毒血清对于中和蛇毒中致死毒性的效价

抗原的致死性（LD50）通过大剂量腹腔注射五组八只小鼠（18-22 g）来确定。用ED50来测定制备抗体的中和效果，将2 LD五种毒液混合的混合毒液用越来越多的抗蛇毒血清样品中和，在37 ℃下孵育30 min，然后给八只小鼠接种混合的抗蛇毒血清，通过LD 50和ED 50，确定腹腔注射的最终体积为0.5 ml，检测小鼠状态48 h。世界卫生组织确定了抗蛇毒血清的疗效建议，并通过概率的分析计算。

2.10 蛋白测定

用福林酚法测定蛋白质浓度，用0.1-1毫克/毫升浓度牛血清蛋白范围制作标准曲线。

2.11 统计分析

矛头蝮蛇毒特异性抗体检测采用ELISA，比较采用t检测。所有值均以SD平均值表示，p＜0.05时才有统计学意义。

1. 结果

3.1 卵黄抗体的提取

卵黄免疫蛋白提取的结果列于表1，表明水在PH为5时1:10进行稀释然后进行冻融循环具有最高的活性恢复能力。因此被指定为100%的收益率。它被命名为水可溶部分（WSF）。相对而言，CA为68.4%，PEG仅为47.4%。

表1 不同方法提取水溶性蛋白对特异性抗体回收率的影响

注：每种方法使用的蛋黄体积：10 ml

3.2 抗体反应

图1显示了在第一、第二和第三免疫周期后产生抗体的特异活性水平。免疫反应在AFI和三周盐水增压后两周内急剧增加。在材料和方法的描述中说到：8/9周、14/15周注射后二次反应保持直到25周。超过10周时间，再次免疫时，抗体水平依旧很高。此外，在25周的实验中，CFA和IFA注射的母鸡没有发现广泛的病变或临床反应。这些结果都表明了提高矛头蝮蛇毒液IgY抗体持续时间的可行性。

图1 在25周后与第一次矛头免疫卵黄抗体生产曲线

注：箭头表示免疫时间；较大箭头表示注射30 ml抗原，较小箭头表示注射10 ml

3.3 IgY纯度

分析了在不同浓度的AMS沉淀下IgY纯化后WSF的情况，显示如图2.SDS-PAGE分析在7.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳下分析验证IgY纯度。WSF（30毫升）被15%、20%、25%、30%和35%（w/v）AmS沉淀。另外，通过离心法分离出上清液再测定其特异性活性。这些结果见表2。根据图2和表2，获得IgY纯度高活性最佳的AmS的浓度为20%（w/v）。图2表明IgY沉淀最高的纯度是15%（w/v），但如表2所示回收率由于ELISA测定上清液活动剧烈而变低。IgY在20%（w/v）AmS沉淀后纯度也高（图2，条带2），虽然在上清中仍然有14%的IgY损失。当AmS浓度高于20%（w/v），第3～5条条带显示，表明非特异性蛋白的高沉淀为污染物。因此，沉淀用20%（w/v）AmS为最适浓度纯化IgY，因为它没有造成特异性IgY活性的较大损失且达到了很高的纯度，这些都通过体外试验证明了。

3.4 IgY产量

我们进行了蛋白提取制备WSF，导致81%的恢复（表1）。从30毫升的WSF（3.7毫升蛋黄）中纯化了9.5毫克IgY（表2）达到了2.57毫克/毫升卵黄蛋白提取产量。如蛋黄在我们的实验中使用的平均体积为15.5毫升，一个鸡蛋蛋黄IgY产生量为39.8毫克。因为母鸡每年下250-300个鸡蛋，每年的卵黄体积将生产3.875-4.650 L/每鸡或9.950-11.940 g/每鸡/每年。

图2 SDS-PAGE分析（7.5%凝胶浓度、非还原条件下）之前和沉淀的AMS后蛋黄提取物

注：M-分子标记在左边显示；卵黄水提取WSF蛋白；条带1-5显示蛋白质的AMS用不同浓度（15%、20%、25%、30%、35%，w/v沉淀）

表2 硫酸铵沉淀后蛋黄水提物分析

<t

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料</t

英语原文共 6 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[281397]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word