南高丛蓝莓品种叶片外植体不定芽再生外文翻译资料

 2023-01-07 04:01

南高丛蓝莓品种叶片外植体不定芽再生

Cheng Liu bull; Pete Callow bull; Lisa J. Rowland bull;James F. Hancock bull; Guo-qing Song

摘要:研究了4个南方高丛蓝莓品种不定芽再生的优化方法。将4个品种6周龄枝条的叶片外植体分别取下,分别在含硫唑仑(4.54或9.08mu;M)、玉米素(18.2mu;M)和玉米素核苷(5.7或11.4mu;M)的木本植物培养基上培养,或与含a-萘乙酸(2.69mu;M)的培养基结合培养。促进胚芽再生的最佳培养基与基因型相关。lsquo;Jewelrsquo;、lsquo;Emeraldrsquo;、lsquo;Jubileersquo;和lsquo;Biloxirsquo;的再生率分别为88.9%、87.8%、53.3%和87.8%。经过5次继代培养的新芽叶片外植体再生率高于经过2次继代培养的新芽叶片外植体再生率。再生苗,每个品种80-100%,移栽后8周生根。所述再生体系在南方高丛蓝莓品种的遗传转化中具有潜在的应用价值

关键词:器官发生; 植物再生; 伞房花越橘;

介绍

越桔水果被认为是促进健康的食物,因为相对较高的抗氧化剂和抗炎症能力 (Prior et al. 1998; Ehlenfeldt and Prior 2001; Conner et al. 2002a; b; Zheng and Wang 2003;USDA-ARS 2007)。三种越橘水果作物(蓝莓、蔓越莓和越橘)已在二十世纪被驯化(Galletta and Ballington 1996;Lyrene et al. 2003; Hancock et al. 2008a)。其中,高灌木蓝莓是迄今为止最重要的商业作物。从1995年到2007年,全世界蓝莓种植面积从23,116公顷增加到58,601公顷(Lehnert 2008)。越桔品种完全是通过传统的控制杂交和精心选择产生的。据报道,重组DNA和转化技术可以补充和扩展蔓越莓的传统育种方法 (Serres et al.1992, 1997; Polashock and Vorsa 2002a; b; Zeldin et al.2002)和蓝莓(Graham et al. 1996; Song and Sink 2004; Song et al. 2008)。虽然转基因育种可以在将传统育种不可能的理想农艺性状引入商业疫苗品种方面发挥重要作用,但显然必须首先制定可靠、有效的转化方案

植物再生是遗传转化的先决条件步骤,通常受包括基因型,外植体类型在内的生物因素以及培养基和环境条件等非生物因素的影响。虽然植物细胞全能性理论上使任何一个细胞都能够通过器官发生或体细胞胚胎发生来保持整个新植物的再生能力,但植物细胞的再生能力通常在物种、品种和外植体类型之间有所不同 (Ganeshan et al. 2002)。已报道了五种疫苗的成功植物再生,包括低丛蓝莓(V. angustifolium Ait.)(Nickerson and Hall 1976; Nickerson 1978, 1980; Dweikat and Lyrene 1988),高丛蓝莓 (V. corymbosum L.)(Billings et al. 1988; Callow et al. 1989; Rowland and Ogden 1992, 1993; Hruskoci and Read 1993; Cao and Hammerschlag 2000; Song and Sink 2004),大蔓越莓(V. macrocarpon Ait.) (Serres et al. 1992, 1997; Marcotrigiano et al.1996; Qu et al. 2000),越橘 (V. vitis-idaea L.)(Debnath and McRae 2002; Debnath 2005; Meiners et al.2007),欧洲越橘(V. myrtillus L.) (Shibli and Smith 1996)大部分的再生是通过器官发生的。

在南方高丛蓝莓方面,有报道称,两个杂交品种“Legacy”( 73.4% V. corymbosum, 1.6%

V. angustifolium, and 25% V. darrowi)和“Ozarkblue”(77.4% V. corymbosum, 3.9% V. angustifolium, and 11.3%V. darrowi) (Song and Sink 2004; Meiners et al. 2007)利用叶片外植体进行不定芽再生 (Song et al. 2007, 2008)。然而,由于南方高叶灌木品种的遗传组成差异较大(Brevis et al. 2008; Ballington 2009),目前仍需要系统的研究来优化单个品种的再生体系。以4个南方高灌木品种为材料,利用叶片外植体建立了高效再生体系,结果表明,品种来源和叶片外植体的生理状态均对植株的再生有影响,该方法对其他越桔品种的枝条再生系统的优化具有潜在的应用价值。

材料和方法

植物材料和培养基

采用70% (v/v)乙醇30 s和3% (v/v)次氯酸钠(含0.02% (v/v) Tween 20)表面消毒10 min,然后在无菌水中冲洗3次。将长约0.5 - 2cm的单节段外植体转移到培养管(150times;25 mm)中,每个含有10 ml修饰的MS培养基,含有0.4 mg l-1硫胺-氯化氢的无机盐,100mg l-1 肌醇,25 mu;M 6( gamma;,gamma;dim-乙基烯丙基氨基)-嘌呤(2-异戊烯腺苷)(2ip),2%的蔗糖,0.6%的细菌琼脂,pH调整到5.2。在6周后,6到10个新发育的嫩芽,长2-6厘米,被水平放置在40x100mm含有30毫升改良木本植物培养基的玻璃罐中(WPM) (Lloyd and McCown 1980),培养基中含有WPM盐和MS维生素加9.12升玉米素、2.35mMCa(NO3)2∙4H2O、2%蔗糖,用0.6% 细菌琼脂凝固,pH5.2 (Rowland and Ogden 1992; Song and Sink 2004)。再培养6周,增殖芽每6-8周传代一次,除另有说明外,分别经过2次和5次继代培养的新培养的芽被用作叶片外植体的来源,所有培养物均保持在25℃下,在16h光周期为30mu;Em-2s-1的冷白色荧光管光下培养。所有介质均在121°C, 105kpa条件下蒸压20分钟,玉米素、玉米素核苷或TDZ通过0.22lm微孔滤器过滤灭菌,加入介质中冷至50-60℃。

不定芽再生

基本再生培养基为WPM盐、MS维生素、2%蔗糖、0.6%细菌琼脂、ph5.2。根据我们以前的报告(Song and Sink 2004)和初步的不定芽再生试验,分别对三种植物生长调节剂(PGR)TDZ(4.54或9.08mu;M)、玉米素(18.2mu;M)和玉米素核糖苷(5.7或11.4mu;M)进行了试验,或分别与alpha;-萘乙酸(NAA)在2.69mu;M下组合进行了试验,得到10个再生植株分别或每种与甲萘乙酸(NAA)在2.69升M处进行检测,得到10个再生处理。(表1)。

在含有9.12mu;M玉米素的改良WPM上进行了2次和5次继代培养,从6周龄的新芽上切下长约4~8mm的叶片外植体,不包括靠近每梢顶端的3片幼叶。在去除叶柄和叶片的远三分之一部分后,剩余的近端部分是用于芽再生的外植体。

新鲜制备的外植体,每个培养皿10个(100x20mm),每个处理3个培养皿,置于30ml再生培养基上,背面与培养基接触。培养皿在25plusmn;1℃的黑暗中培养2周,然后暴露于冷白色荧光管的30mu;Em-2s-1的16h光周期,每4周将外植体转移至新鲜培养基。之后培养12周,记录再生频率(至少有一个芽的叶片外植体的百分比)和每个外植体的芽数。

为每个品种随机选择10个再生外植体,并转移到40x100 mm玻璃罐中,每个玻璃罐中含有30 ml改良WPM和9.12mu;M玉米素,以便继续生长。培养物在25℃、30mu;Em-2s-1的16小时光周期下生长8周。然后,从每个品种的最佳再生培养基中选出10个长3-5cm的细长芽进行生根。

表1 4个南方高丛蓝莓品种在WPM基再生培养基上培养12周后的不定芽再生

列中数值旁边的字母表示邓肯检验Plt;0.05时的显著性差异,n=180(培养皿数量)

y平均芽数/外植体(9个培养皿,每个培养皿10个外植体)

z再生(%)=至少有一个芽的外植体数/外植体总数times;100(9个培养皿,每个培养皿10个外植体)

生根

再生芽的生根按照Song and Sink(2006)的描述进行,切下3-5厘米长的细长嫩枝,并将其直接插入6-paks细胞托盘((Novosel Enterprises,PA, USA).)中浸水的泥炭藓中。在每个试验中,每个品种20个芽进行生根试验,其中再生芽10个,微繁殖芽10个。用透明塑料盖覆盖细胞托盘,并在25℃下在30mu;Em-2s-1的16 h光周期下培养。6周后,逐渐打开并移除塑料盖。8周后记录生根率。将所有植物移栽到4英寸的塑料盆中,塑料盆中含有浸水泥炭藓 (Fafard Peat Moss Co.Ltd. Inkerman, NB, Canada)和Suremix珍珠岩种植培养基(Michigan Grower Products Inc., Galesburg, MI,USA) (v/v = 1:1)根据需要浇水,每周使用0.2 g/L 21-7-7酸性肥料的营养液施肥。

实验设计与数据分析

所有实验均采用完全随机设计进行三次。不定芽再生数据采用标准方差分析(ANOVA)进行显著性分析,平均分离度采用邓肯检验(P=0.05);采用SAS 9.2(SAS Institute, Cary, NC) 的PROC GLM或ANOVA。

结果与讨论

试管苗生长与增殖

在含有25mu;M 2ip的改良MS上6周后,四个品种中每一个的节段的60-85%不育并产生新梢(图1a)。在含有改良WPM和9.12mu;M玉米素的茎增殖培养基上,经过4次继代培养,4个品种均获得了稳定、均匀的茎段培养物。

从形态上看,在前两次继代过程中,新获得的芽在芽增殖培养基上的培养不稳定。生长旺盛,5~20%的植株表现出茎叶呈红色或浅绿色等胁迫症状。此外,与四次继代后稳定的更均匀的茎培养物相比,不稳定的茎培养物具有更厚的茎、更大的叶和更低的增殖率(图1b,c)

叶片外植体不定芽再生

为了建立四个品种的高效再生体系,我们测试了10个PGR处理。无论是品种还是处理都对芽再生有显著影响(表1)。根据基因型和处理方式的不同,芽再生可通过模式I观察,其中再生剂主要出现在外植体的切割边缘或伤口部位(图1d),或通过模式II观察,其中再生剂出现在叶片外植体的整个表面(图1e)。用于芽再生的PGRs的最佳组合是基因型依赖的(表1)。

lsquo;Jewelrsquo;的再生表现为模式I,仅在含有4.54 lM TDZ和2.69 lM NAA的培养基上再生(表1)。lsquo;Jubileersquo;在模式I中与lsquo;Jewelrsquo;相同的培养基上再生最优;此外,在含有玉米素核苷(5.7或11.4 lM)的培养基上,也可发生芽再生(表1)。“Emerald”和“Bioloxi”在不同的培养基上均可发生芽再生。在单独含有TDZ(4.54或9.08 lM)或与NAA结合的培养基上,再生外植体大部分为模式I;其他培养基上的枝条再生多为模式II。“翡翠”再生的芽在7个媒体,其中5给予超过75%的再生频率。祖母绿植株的最佳再生培养基为TDZ(4.54或9.08 lM)、玉米素(18.2 lM)或玉米素核苷(11.4 lM)(表1)。最适再生培养基为11.4 lM玉米蛋白核苷(表1)。

TDZ诱导的芽/芽在同一含TDZ的再生培养基上非常缓慢地伸长。在含9.12mu;M玉米素的改良WPM上,各PGR处理的再生芽均能继续生长,与亲本继代相比,形态无明显差异。同样,对于北方高丛蓝莓品种和野生低丛蓝莓(Vaccinium angustifolium Ait.)也报道了两步再生策略,即使用TDZ诱导芽/芽形成,然后使用玉米素促进芽伸长(Song and Sink 2004;Debnath 2009)

图1南方高丛蓝莓新梢培养基的建立及不定芽再生。a在含25mu;M 2ip的改良MS上生长表面灭菌的lsquo;Emeraldrsquo;枝段6周后,b在前2-3次继代中获得不稳定的lsquo;Emeraldrsquo;芽培养物,注意到斑驳和漂白的叶子,c稳定的lsquo;Emeraldrsquo;芽培养物。

通过四次继代培养获得的lsquo;Emeraldrsquo;。lsquo;Jewelrsquo;叶片外植体在含4.54mu;M TDZ和2.69mu;M NAA的WPM上培养12周的Ⅰ型不定芽再生;lsquo;Emeraldrsquo;叶片外植体在含18.2mu;M玉米素的WPM上培养12周的Ⅱ型不定芽再生;f生根苗在温室中生长3个月。

WPM是越橘属植物再生常用的基本培养基。几种pgr,如2ip、玉米素、玉米素核苷、TDZ或NAA,通常用于越桔属植物的不定芽再生。TDZ单独使用或与NAA或2ip联合使用都能实现越桔的高效芽再生(Hruskoci and Read 1993;Marcotrigiano et

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