矮丛蓝莓离体叶片不定芽再生的两步法外文翻译资料

矮丛蓝莓离体叶片不定芽再生的两步法

原文作者：S. C. Debnath

单位：Atlantic Cool Climate Crop Research Centre ,

Agriculture and Agri-Food Canada

摘要：以温室栽培的野生矮丛蓝莓为材料，建立了一套高效的离体再生系统。研究了噻苯隆(TDZ)对叶片顶端、中间和基部不定芽和新梢形成的影响。在含2.3 ~ 4.5mu;M的TDZ培养基上，培养6周即可产生带或不带愈伤组织的芽和新梢。在黑暗中培养2周，最大的再生芽来自于幼嫩展开的基部叶片，近轴处接触培养基。愈伤组织的形成和不定芽的再生不仅取决于外植体的极性，而且还取决于提供外植体材料的克隆体的基因型。将一开始在TDZ培养基中培养的叶片转移到含有2.3-4.6mu;M玉米素的培养基中继代培养，即可获得可用的芽。将伸长的芽浸入39.4 mM的吲哚-3-丁酸粉中，然后种植在泥炭：珍珠岩体积分数比为3:2的无土培养基中，生根率为80-90%。幼苗经过驯化，最终在温室中生长，成活率为75-85%。

关键词：器官形成；矮丛蓝莓； 离体培养；瓶外生根

引言

矮丛蓝莓是一种多年生、根茎状、异花授粉的灌木，原产于纽芬兰和拉布拉多，分布范围从北美东北部到中部（Vander Kloet 1988）。在缅因州、魁北克省和加拿大大西洋省是一种重要的商业作物。2007年，加拿大在农场大门口生产了42293吨矮丛蓝莓，价值超过8900万美元(Makki 2008)，缅因州生产了34836吨，价值7200万美元(Geisler 2008)。大部分这种作物被加工成单独速冻或罐装浆果，只有1%的作物作为新鲜包装出售(Crowe et al. 2005)。矮丛蓝莓广泛应用于果汁饮料、饮料、烘焙食品、麦片、酸奶、冰淇淋、糖果、果酱、果冻、派和其他加工食品。其果实具有较高的花青素含量（Kalt et al.1999），具有重要的治疗价值，包括抗肿瘤、抗溃疡、抗氧化和抗炎活性（Cristoni and Magistreti 1987；Kamei et al.1995；Wang et al.1999）。

由于对高品质浆果的需求不断增加，1999年启动了一项利用生物技术和经典育种技术开发改良矮丛蓝莓品种的计划（Debnath 2000）。从腋芽分生组织克隆矮丛蓝莓的方法已获得成功(Debnath, 2004)，从而可以更快地将优良种质引入越橘产业。从植物的体细胞组织(如叶子)上再生芽是可靠的，这使矮丛蓝莓的基因操纵成为可能。植物的再生能力是体外方法成功应用的关键(Cao and Hammerschlag 2000)。不定芽再生系统可用于鉴定和诱导体细胞无性系变异，并在植物细胞遗传转化后培育转基因植物。体外育种是传统育种方法的补充，其目的是在最短时间内将新性状引入选定植株，繁殖无性系植株，并培育出合适的品种。虽然矮丛蓝莓叶片组织的植株再生尚未被记录，但有其他越橘属植物叶片再生不定芽的报告，包括:高丛蓝莓(Rowland and Ogden 1992; Cao and Hammerschlag 2000; Meiners et al. 2007); 半高丛蓝莓(Graham et al. 1996); 蔓越莓 (Marcotrigiano et al. 1996; Qu et al. 2000); 越橘(Debnath and McRae 2002; Debnath 2005; Meiners et al. 2007); 覆盆子 (Shibli and Smith 1996); 纲状越橘(Shibli and Smith 1996)。

本研究报告的目的是通过使用噻苯隆(TDZ)，一种具有细胞分裂素和生长素效应的取代苯脲化合物，通过温室矮丛蓝莓叶片的器官形成来确定体外植株再生的最佳条件(Visser et al. 1992)。TDZ已被证明在诱导越橘（Debnath 2003）、纲状越橘和覆盆子（Shibli和Smith 1996）以及几种木本植物（Huetteman和Preece 1993）的离体芽再生方面非常有效。但TDZ对矮丛蓝莓离体不定芽再生的有效性尚未得到证实。

材料和方法

外植体来源：

从三个野生无性系获得的生长活跃的矮丛蓝莓幼叶：lsquo;QB1rsquo; 和 lsquo;QB2rsquo;, 从魁北克收集而来，以及lsquo;PB1rsquo;, 从加拿大爱德华王子岛收集而来。被保存在自然光照条件下，最大光合光量子通量(PPF) 为90 micro;mol m^-2 s^-1 ,温度为20plusmn;2°C, 湿度为85%的一个温室中。叶子在自来水中冲洗，后在2%的棕榄(高露洁-棕榄加拿大公司，加拿大多伦多)洗洁精洗涤2分钟,再在0.79%次氯酸钠溶液(15%商业漂白剂)和0.1% Tween -20配成的溶液中进行表面消毒20分钟,再迅速在70%乙醇中冲洗，最后在消毒去离子水中清洗三次。

TDZ浓度和外植体极性对叶片外植体产生不定芽的影响（实验1）：

叶片的所有预培养操作均在无菌滤纸上进行，滤纸中加入了改良的蔓越莓培养基(Debnath和McRae 2001a)，其中含有四分之三的大量营养元素和微量营养元素的芽增殖培养基 [下文称为基础培养基(BM)]，以防止干燥。最终每升BM含有30克蔗糖，3.5克Sigma A 1296琼脂，和1.25克Gelrite（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）。将培养基pH值调节至5.0，然后在121°C高压环境中灭菌20分钟。TDZ经过过滤灭菌，加入到高压灭菌后冷却至40-50℃的基础培养基中。通过横切叶片获得 lsquo;QB1rsquo;顶端、中部和基部的叶段，并将其转移到100times;25 mm的无菌一次性培养皿中，培养皿中含有25 ml BM，各培养基中的TDZ浓度分别为0, 2.3, 4.5, 9.1 mu;M。采用裂区设计，以TDZ浓度为主要影响因素，叶段为次要影响因素，将一片叶片的9个外植体，每个极性3个外植体，依次放置于同一培养皿中，从叶尖到叶基，近轴面与培养基接触。培养皿沿边缘用两层封口薄膜密封。培养皿在在培养箱中随机放置。每个处理设4个板，实验共进行2次，共32个平板。在20plusmn;2°C的黑暗中培养2周后，将培养物暴露于光下，冷白荧光灯提供16小时光周期（PPF密度为30micro;mol m^minus;2 s^minus;1）的条件下培养。

基因型对不定芽再生的影响（实验2）：

以 QB1 、 QB2 和 PB1 为材料，用手术刀在近顶端分生组织的几乎完全展开或完全展开的叶片的叶柄基部处切取4片叶片，并在不完全展开叶片的中脉切取5片横切。将8片准备好的叶片正面朝下转移到100times;25 mm无菌一次性培养皿中，培养皿中含有2.3mu;M TDZ的BM 25 ml。每个处理设4个平板，试验共进行3次，共36个平板。按照与实验1相同的步骤培养。

玉米素浓度对芽伸长的影响(实验3 )：

以 QB1 、 QB2 和 PB1 叶片外植体为材料，在含2.3 mu; M TDZ的BM培养基上培养8周后，收集芽和丛生芽(实验2 )，随机转移到含有0、2.3、4.6或9.1 mu; M玉米素的BM 35ml的175ml Sigma婴儿食品玻璃瓶（Sigma Chemical Co.）中。玉米素经过滤灭菌，加入到经过高压灭菌冷却至40-50℃的基础培养基。容器用聚丙烯透明盖盖，用封口膜密封，并在相同的光周期、光强度和温度下培养再生。每个处理设4个罐子，试验进行3次。

生根和驯化：

从培养在含有玉米素（2.3或4.6mu;M）的BM上的外植体上切下2-3 cm长的芽，浸入39.4 mM吲哚-3-丁酸（IBA）粉末（Stim-Root # 3, Plant Products Co. Ltd., Brampton, Ontario L6T 1G1, Canada）中，并种植在45孔穴盘（直径为5.9 cm，深度为15.1 cm；Beaver Plastics，Edmonton，Alberta T5V 1H5, Canada），含三份泥炭和两份珍珠岩。从培养在含有2.3mu;M TDZ的BM上的 lsquo;QB1rsquo;、lsquo;QB2rsquo;、lsquo;PB1rsquo;的克隆体中获得不定芽，培养8 周，伸长不超过5 ~ 7 mm，未纳入生根实验。将托盘放置在温度为20plusmn;2°C，湿度为95%，光周期为16小时，PPF 为55micro;mol m^minus;2 s^minus;1的湿度室中生根。将幼苗移栽到含有相同生根培养基的塑料盆中，塑料盆体积为10.5 ( L ) times; 10.5 ( W ) times; 12.5 ( D ) cm3，在2-3周内通过逐渐降低湿度进行驯化。在温室中保持温度为20plusmn;2°C、湿度为85%和16小时光周期，PPF为90micro;mol m^minus;2 s^minus;1，使植物适应环境。在第6周时从湿度室移出，记录存活植物的数量。

数据收集和统计分析：

在试验1和试验2中，培养8 周后，分别记录每个处理带愈伤组织和不定芽长度大于1 mm的外植体频率、每个再生外植体的芽数、新梢数以及芽活力。活力以1 (强烈玻璃化、坏死和/或畸形芽) ~ 8 (完全正常和健康芽)为等级进行视觉评估。愈伤组织按无愈伤组织形成（0）和最少（1）到最多（8）的生长分级。

试验3在第8周时测定各处理下存活外植体的以下生长特性：每个外植体产生的大于2mm的芽数、芽长（cm）、每芽叶片数和芽活力。活力通过视觉评估来确定，分8个等级：1、芽玻璃化强、坏死和/或畸形；2、芽玻璃化弱、坏死和/或畸形；3、芽无玻璃化但活力极差；4、芽活力较差；5、芽活力一般；6、芽活力良好；7、芽活力极好；8、芽活力极好、完全正常健康。

用SAS统计软件包( Release 8.2，SAS Institute，Inc .，Cary，NC )对除芽活力和愈伤组织大小外的所有性状进行方差分析。在方差分析之前，将再生率转化为角度，每个外植体的芽数、新梢数转化为平方根尺度，以稳定方差。实验1中，0和9.1mu;M TDZ的数据被排除在分析之外，因为没有外植体对芽再生有反应。统计学F检验以Ple;0.05为标准。采用Duncan 多重范围检验进一步处理间的差异。采用分类分析法( SAS中的CATMOD程序)分别对芽活力和愈伤组织大小进行分析，并采用CATMOD程序中的contrast statement比较各处理组合间的差异。这种方法适用于分类数据的分析(Compton 1994年)，并允许评估主要影响和相互作用项(如方差分析)。

结果和讨论

图1. 矮丛蓝莓QB1无性系在营养培养基上的形态建成及幼芽驯化。( A )在TDZ浓度为2.3 micro;M的培养基上接种4周后，叶片和基部叶段叶缘的形态建成。（B） 在2.3micro;M TDZ上接种8周后，基部叶段上的芽和芽丛。（C） 将8周龄不定芽（在2.3micro;M TDZ上从整片叶发育而来）转移到含4.6micro;M玉米素的基本培养基8周后伸长的芽。（D）将幼苗转移到泥炭-珍珠岩培养基1年后生长的芽和根。（E） 一年生的叶片培养驯化出的植株。

表1 . TDZ浓度和叶段外植体对QB1矮丛蓝莓叶片离体培养8周后愈伤组织形成及芽、新梢再生的影响

外植体类型——顶端=A，中部=M，基部=B

^Z角度变换

^y愈伤组织大小以无愈伤组织形成（0）和最小（1）到最大（8）生长为标准

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