外源生长素通过刺激半纤维素1和增加根细胞壁镉固定能力减轻拟南芥镉毒害外文翻译资料

外源生长素通过刺激半纤维素1和增加根细胞壁镉固定能力减轻拟南芥镉毒害

原文作者 Xiaofang Zhu,Zhiwei Wang ,Fang Dong, GuiJielei ,Yuanzhi Shi,Guixin Li,Shaojian Zheng

摘要：生长素不仅参与了植物生理和发育的过程，而且也参与了植物的非生物性胁迫。在这项研究中，镉胁迫减小内源生长素水平，而外源生长素（alpha;-萘乙酸，萘乙酸，可渗透生长素类似物）减少地上部分镉浓度并减轻在拟南芥中镉诱导的黄化。在镉胁迫条件下，萘乙酸在根部增加Cd2 的保留并且大多数镉在根部被固定在细胞壁半纤维素1上。 NAA处理不影响果胶含量和Cd2 的其结合能力，但它显著增加半纤维素1的容量和保持在里面镉的量。当植物经受镉或者镉和萘乙酸处理1到7天后，根中镉含量与细胞壁和半纤维素1有明显相关性。有这表明在半纤维素1的增加大大有助于镉在细胞壁的固定。将二者结合，这些结果表明，在拟南芥中镉生长素诱导减轻镉毒害是通过增加半纤维素1含量和镉（Cd2 ）在根中固定，从而减少镉从根到芽的转移为介导实现的。

关键词：拟南芥； 生长素； 镉胁迫；细胞壁；半纤维素1；根

1.引言

镉（Cd² ）几乎对所有生物都有剧毒。暴露于镉中，植物表现为叶卷跌和叶褪绿，并且减少生长[1]。植物进化出几种机制，以应付镉毒害，如细胞壁结合，螯合与植物螯合肽，液泡分隔化，和分配的调节[2]。尽管在根细胞质膜没有具体镉转运已经确定，在植物中，镉被认为是通过由用于钙，铁，锌相同的等离子体通道的根膜转运[2]。

植物激素涉及了Cd² 的毒性/阻力。例如，内源脱落酸(ABA)的含量的增加与水稻（Oryza sativa L.）幼苗中镉离子的耐受性密切相关，并且ABA外源性的应用可降低它们的蒸腾速率，降低镉浓度，并提高Cd² 的耐受性[3]。此外，水杨酸应用可以一定程度上防止大麦幼苗的镉毒害[4]。赤霉酸（GA）也可以减少重金属在水稻枝条的积累并减轻其对蚕豆，羽扁豆和拟南芥镉与铅的有害影响[5]，[6]和[7]。

生长素是起着关键作用的植物生长和防御的协调的重要激素。作为自然最丰富存在的生长素之一，吲哚-3-乙酸（IAA）影响涉及了基本生理和发育过程，如根伸长，根向地，根毛开发和侧根形成的[8]，[ 9]，[10]，[11]和[12]。植物组织中的生长素水平已经显示了在如拟南芥暴露于Fe² 的不足环境压力中，番茄[14] [13]在盐胁迫中，和大豆处于Cd² 环境中[15]，它们的含量会增加。 Xu等人[16]研究发现，镉胁迫通过增加在根部的苜蓿幼苗中IAA氧化酶的活性抑制IAA的积累，而外源的一氧化氮可以通过保留在植物中的生长素平衡缓解Cd² 的毒害。另外因为合成生长素比天然生长素IAA更稳定已经被报道出来[17]，alpha;萘乙酸（NAA，IAA的类似物）经常被研究者使用。 NAA主要通过被动扩散进入植物，它比IAA 代谢更慢[18]和[19]。 NAA可以缓解玉米镉/镍离子的毒害和水稻的Cd² 胁迫[20] [21]，从而表明其在重金属污染的植物修复中有一个可能的应用。然而，生长素（如IAA或NAA）改变Cd² 的积累，运输和毒性的生理学原理仍不清楚。

在本研究中，我们通过揭示生长素，半纤维素1中Cd² 的结合能力，以及Cd² 在拟南芥中从根到地上部分的的转移之间的新联系，阐明生长素缓解镉毒害的潜在生理学机理。

1. 材料和方法

2.1 植物材料和生长条件

本研究实验采用哥伦比亚生态（Col-0中）的拟南芥。种子在4℃春化处理2天并在浸泡过海绵的营养液中萌发。然后，将幼苗转移到充满营养的液体容器中。营养溶液由以mM为单位的下列营养素：KNO₃，6.0;的Ca（NO₃）₂，4.0;硫酸镁，1; NH₄H₂PO₄，0.1，和以mu;M为单位的下列微量营养素：Fe（III）-EDTA，50; H₃BO₃，12.5;硫酸锰，1;硫酸铜，0.5;硫酸锌，1; H₂MoO₄，0.1;根据Murashige-Skoog进行一些修改[22]的盐硫酸镍0.1配制而成。最终pH用1M HCl或1M的NaOH调节至5.6。营养溶液在幼苗期每周更新换一次。幼苗控制在22plusmn;2℃，140微摩尔光子M-2 S-1和16/8ħ昼/夜为周期的环境条件下。

2.2 镉浓度的测定

实验在由上述营养液培养六周龄的植物中进行。在镉处理试验中，加50mu;M氯化镉，一组加0.05 mu;M的NAA到该溶液中，另一组则不加NAA。在生长素浓度梯度实验中，每组加50mu;M氯化镉，各组加0.005，0.01，0.05，0.1或0.5mu;M五个梯度的NAA到该溶液中。处理7天之后，收获幼苗根并用去离子水洗涤两次。对于时间过程实验，根样品在7天中每日收集。根据Gajewska等[23]的一些修改，将植物材料消化处理。样品在2毫升浓HNO3 /高氯酸（4：1，V / V）90℃下恒温水浴4小时。轻轻摇动后，将温度升高至130℃约24小时，直到溶液变得透明。 消化物在10毫升的超纯水过滤。总金属浓度通过电感耦合等离子体原子发射光谱法（; Fisons ARL Accuris，埃居布朗，瑞士ICP-AES）测定。为了评估分析方法的准确性，使用了标准溶液56的ICP分析（ 多元素校准标准GSB 04-1767-2004来自中国）。并配制空白对照组，以确定试剂的纯度。每一组分析中设都有四个平行重复实验。

细胞壁中的镉由2当量盐酸间歇震荡24小时来提取。提取的Cd² 的浓度是通过上述电感耦合等离子体原子发射光谱法确定的。

2.3 基因表达分析

被镉离子处理的植物在相同的条件下生长。7天后提取根组织，并在处理收集和提取总RNA之前放在液氮中冷却。总RNA使用Trizol（Invitrogen）分离出来。 cDNA用PrimeScript RT试剂盒（Takara公司）从1微克的总RNA制备。为了实时RT-PCR分析，1微升10倍稀释的cDNA被用于执行SYBR预混料ExTaq（Takara公司）用以下对基因特异性引物IRT1进行的基因表达定量分析：正向：5-CGGTTGGACTTCTAAATGC -3;反向：5-CGATAATCGACATTCCACCG-3; ZIP1：正向：5-AGACACCATAAAGCCACTCA-3;反向：5-TTTCCTGTAGCCTAAACCAC-3; ZIP3：正向：5-TAGGAATCGTTGTGGGAATG-3;反向：5-AGGGTGCGTGAAATCTGC-3; ZIP4：正向：5-TCTTTCAACTCGCATAGCCC-3;反向：5-AAGCCTCAAATTACAACTCATCCT-3。

每种cDNA样品在反应使用中一式三份。表达数据标准化为微管蛋白的表达（正向：5-AAGTTCTGGGAAGTGGTT-3;反向：5-CTCCCAATGAGTGACAAA-3）。

2.4 细胞壁提取分馏

粗细胞壁材料和之后细胞壁组分分级提取是根据zhong和Lauml;uchli[24]使用根据Zhu等人小的修改进行。[1]。根放在液氮中用研钵和杵中，在冰水中用75％乙醇均化20分钟研磨，并用4579g离心10分钟，之后除去上清液。颗粒均匀，并用丙酮，甲醇：氯仿（1：1），和甲醇洗涤20分钟/次，每次离心后除去所有上清液。剩余的小球，即，细胞壁材料，冷冻干燥并储存在4℃下供进一步使用。

果胶是从上述细胞壁（约2毫克）用1mL水，100^oC，1h/次，提取三次而来。将上清液组合在一个5毫升的管离心后，16,800g 离心10分钟。 然后，果胶提取残渣进一步用1mL 4％（重量/体积）氢氧化钾和0.02％（重量/体积）KBH 4提取两次，在室温下搅拌12小时。两个上清液合并于一个2毫升管中，并1680g离心10分钟，得到半纤维素1（HC1）组分上清液。

2.5 糖醛酸和总多糖测量

果胶中糖醛酸含量根据Zhu等人测定。 [1]使用半乳糖醛酸（Sigma公司）作为标准。简要地说，上述200微升的果胶提取物，用1毫升98％H ₂SO₄（ 含有0.0125中号硼砂·10H2O）在100℃下5分钟恒温水浴。冷却后，将20微升的M-水力二苯基（0.15％）加入到该溶液中并在室温下20分钟后，通过分光光度法在吸光度520nm处测定。

半纤维素中总多糖含量是由酚硫酸法[25]来确定，并表示为葡萄糖当量。简言之，将200mu;L的盐酸提取物用1mL 98％H2SO4，在室温下10微升80％的苯酚15分钟恒温水浴，然后100℃下15分钟，冷却后，吸光度在490nm分光光度法测量。

2.6 IAA测量

对于根系IAA浓度的分析，整根（约20毫克）收集每个样品。样品的四次重复进行除了250皮克13C6-IAA内标的后纯化，并通过如由Ljung的等所述气相色谱 - 质谱（GC-MS）分析。[26]。

2.7 统计分析

每个实验至少重复三次。数据用单向方差分析，装置通过邓肯多重范围试验进行比较。直方图不同的字母表示的装置是P lt;0.05水平统计学差异。

3.结果与讨论

营养液中的镉导致拟南芥[1]新长出的叶失绿。实验中，拟南芥幼苗用50mu;M的镉处理7天后，根内源生长素水平降低到未处理的对照（图1）的53％，这表明镉毒性降低了内源生长素的水平。

图1

在Col-0中有或无镉离子处理的IAA的积累。六周龄拟南芥幼苗用（镉）或无（CK）50mu;MCd2 的7天处理。数据是平均值plusmn;标准差（n= 4）。上述栏不同的字母，如a和b表示在P lt;0.05显著差异。

然后用IAA，NAA的类似物进行外源生长素在镉毒害上的应用效果。有趣的是，当NAA与镉（NAA 镉）一起应用时，萎黄失绿病症状显着减少并且地上部分生长改善（图2A）。另外，而镉浓度在根的增加，它在芽（图2B和C）下降，这意味着生长素通过增强根镉固定和减少其转移到地上部分从而减轻地上部分Cd² 的毒害。植物激素被证明涉及植物对镉胁迫的耐受。例如，镉胁迫扰乱根赤霉酸的代谢，并降低一氧化氮（NO）的水平，这又抑制了镉转运蛋白基因IRT1在拟南芥中的表达[7]。一氧化氮（NO）是参与调节镉吸收和转移[27]的若干重要的基因的诱导，而镉胁迫也调控着在根部（未发表的结果）涉及乙烯生物合成的基因。本实验证明了镉胁迫降低根生长素的水平，而外生生长素减少Cd² 向上的运输，并在地上部分缓解Cd2 的毒性。

图2

外源生长素对镉毒性和浓度影响。Cd2 和NAA Cd2 的处理对生长影响（A）；根中Cd2 的浓度（B）和拟南芥地上部分（C）。六周龄植物用含50mu;M镉或50mu;MCd2 的0.05mu;MNAA 7天溶液处理。数据是平均值plusmn;标准差（n= 3）。照片是用数码相机拍摄的。不同栏的字母表示在P lt;0.05显著差异。

尽管细胞壁为Cd² 在植物中的主要存储部位[28]，[29]，但细胞壁中的镉与NAA的更为相关（图3），这表明NAA诱导的细胞壁镉的积累可能有助于在根部镉的滞留。镉中毒可来自质外体和共质损伤，但其中哪种是更切合Cd2 的毒性仍然是一个有争议的问题[1]。在白羽扇豆中，当镉离子浓度超过细胞壁结合能力的时候，细胞壁结合力为第一个作为镉离子的解毒机制，随后在共质体中产生PC[3]。这表明，解毒发生于细胞内或细胞外是依剂量而定的。那么作为第一个镉在生长培养基中接触的器官，根细胞壁将是第一道阻挡并防止镉进入细胞就很合理了。在细胞壁中固定镉将有助于减少镉运输到细胞中。植物激素等营养成分影响镉离子在细胞壁固定。例如，Xiong等人[31]报道NO通过增加在细胞壁中保存的镉离子量缓解水稻根伸长的镉离子诱导抑制，而Zhu等人[1]则表明，通过在拟南芥的根细胞壁减少镉积累，磷（P）的缺乏能减轻镉的毒害。因此，细胞壁镉固定镉离子的双重影响可能是如此：当总Cd² 的吸收降低，如磷不足缓解镉毒害的情况下[1]，细胞壁中少镉的固定可以减轻镉的毒害;而当总Cd² 的吸收增加，细胞壁增加Cd² 固定量，通过减少镉从根到地上部分的转移减轻镉的毒害。

图 3

在根细胞壁中的镉。六周龄植物在含有50mu;M的镉或50mu;M的镉与0.05微米的NAA溶液中生长7天，并从根提取细胞壁材料。由2 M盐酸提取后，通过ICP测定镉。数据是平均值plusmn;标准差（n= 3）。不同的栏上字母表示在P lt;0.05显著差异。

细胞壁主要由纤维素和基质多糖包括果胶和半纤维素[32]合成的。纤维素包括（1→4）直链连接的beta;-D-葡萄糖残基，并且通常被认为是化学惰性的。半纤维素1大大有助于拟南芥细胞壁Al2 和Cd2 的结合[1]，[3

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