茉莉酸对稻瘟病菌的作用机理及对稻瘟病斑可见阶段的防治效果

作者：Yunfeng Wang^1,2 amp; Guihua Duan^1,2 amp; Chunqin Li^1,2 amp; Xiaoqing Ma^1,2 amp; Jing Yang^1,2

单位：1 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of

Bio-Resources in Yunnan, Yunnan Agricultural University,

Heilongtan, Northern suburb, Kunming 650201, Yunnan, Peoplersquo;s

Republic of China

2 Key Laboratory of Agro-Biodiversity and Pest Management of

Ministry of Education, Yunnan Agricultural University,

Kunming 650201, Yunnan, Peoplersquo;s Republic of China

摘要：稻瘟病是世界上最常见的水稻病害之一。在保持产量和品质的同时，通过环境友好的方法提高抗病性至关重要。在水稻侵染前、侵染期间和侵染后，分别在低浓度(100mu;mol/L)和高浓度(400mu;mol/L)条件下获得了具有抗真菌活性的植物激素茉莉酸(JA)。茉莉酸对稻瘟病菌孢子的萌发和附着胞的形成具有剂量依赖性。400mu;mol/L JA处理显著提高了水稻叶片的细胞活力和内源JA水平。在所有处理中，接种稻瘟病菌72 h后喷施茉莉酸的水稻叶片防治效果最好，内源茉莉酸产量最高。而与防御相关的基因OsPR10a和OsAOS2在JA作用下表达显著上调，而OsEDS1基因表达下调。因此，外源JA可激活JA信号通路，有效控制稻瘟病症状。

关键词：稻瘟病; 稻瘟病菌; 茉莉酸；疾病管理; 半生物营养真菌;

1引言

稻瘟病是世界范围内最常见、最具破坏性的水稻病害之一，每年给人类社会造成数十亿美元的损失。它是由半知菌Magnaporthe oryzae引起的。真菌感染可持续存在于水稻整个生长季节，导致定植叶片、穗部和其他植株部位受损，不可避免地造成作物损失(Murmu et al. 2014)。与稻瘟病爆发相关的产量损失可能达到50%甚至更多。据估计，稻瘟病导致全球水稻产量减少约30%，而水稻产量至少可以养活6000万人，更不用说可能涉及的其他收入影响(Murmu et al. 2014;Nalley et al. 2016)。抗病品种的选育和杀菌剂的应用是目前防治稻瘟病的主要策略。然而，这种方法的实际效果受限于稻瘟病菌基因组的不稳定性。该病原菌田间释放后3 ~ 5年就能迅速进化克服抗性植物，需要研究新的基因。杀菌剂带来的问题更加明显，它不仅带来农用化学品污染风险，还可能带来严重的后果，如刺激稻瘟病菌种群对杀菌剂的耐药性(Hasan et al. 2017)。由于稻瘟病的难治性和目前控制措施的不足，有必要就安全性和有效性之间的范围确定新的管理战略。

最近的研究揭示了非生物诱导子，特别是植物激素在作物病害控制中的独特作用(Ferraz et al. 2014;Nafie et al. 2011)。除了调节与生长发育相关的信号网络，植物激素还可以通过刺激防御相关基因的表达来触发植物对病原感染或昆虫食草性的防御反应(De Vleesschauwer et al. 2014;Peng et al,2012)。茉莉酸(Jasmonic acid, JA)及其前体和衍生物，简称茉莉酸酯(jasmonates, JAs)，是一种公认的由叶绿体膜中的亚麻酸合成的植物脂类激素，已被证明参与多种生理和胁迫相关过程 (De Vleesschauwer et al. 2014;Gundlach et al. 1992;Jiang et al 2017;Kim et al 2009)。据报道，在大麦中施用外源茉莉酸甲酯可以提高对白粉病的抗性(Walters et al，2002)。针对外源JAs在植物防御反应中的研究表明，可以诱导植物抗毒素(Tamogami et al. 1997)和上调PR(发病相关)基因，包括水稻叶片中的PR1a、PR1b、PR2、PR5和PR10 (Jwa et al. 2001; Koda 1992; Lee et al. 2001; Liu et al. 2012; Shang et al.2011; Xiong et al. 2012; Zhang et al. 2011, 2017)。在坏疽性感染的情况下，JA的快速积累可以激活PR基因，如PDF1.2、HEL和CHI-B，这些基因编码抗真菌蛋白(Glazebrook 2005;Spoel et al. 2007;Stintzi et al. 2001)。同时，JA在水稻黄单胞菌等半生物营养性病原菌的侵染中发挥着强大的诱导子作用。迄今为止，应用外源JA作为防治稻瘟病菌在稻瘟病斑可见阶段的防治措施尚无报道。JA是水稻天然合成的一种活性代谢物，可以用来预防稻瘟病，且不会影响水稻的品质(Kang et al. 2006;Murmu et al 2014;Nalley et al. 2016)。本研究旨在研究水稻侵染M. oryzae后植株内源茉莉酸水平，以及外源茉莉酸对稻瘟病症状和防御相关基因表达的影响。研究了茉莉酸浓度和喷施方式的多重组合，以确定茉莉酸处理在稻瘟病可见褐斑病阶段的最佳环境友好处理方式，以促进水稻的可持续发展和提高产量。

2材料和方法

2.1水稻品种及其芽孢杆菌培养

丽江新团黑谷(LTH)是一种地方粳稻品种，对几乎所有的稻瘟病菌菌株都高度敏感(Lin et al. 2001)。将稻瘟病菌95234I-1b和35S:MoSTD1/Mo-4的悬液(300mu;L)接种于梅子汁琼脂上，28℃暗培养。培养的稻瘟病菌孢子在无菌水中冲洗，过滤，调整到1times;10⁵CFU/ mL后再接种。

2.2不同浓度JA对孢子萌发和附着胞的影响

将稻瘟病菌菌株置于梅子汁培养基中，28℃暗培养4天，然后昼夜交替(12:12，暗/光)培养6天。用5 mL含有不同浓度JA的无菌水洗涤培养的稻瘟病菌孢子样品，并用纱布过滤。过滤后的溶液混合均匀。JA处理后2 h孢子萌发，10 h附着胞形成。

2.3茉莉酸对稻瘟病菌致病性的影响

将水稻种子消毒，水浸，28℃培养于20 cmtimes;12 cmtimes;5 cm的种植盘中。托盘底部覆盖粗稻谷/腐殖质土，顶部放上筛过的细土，用水浸泡托盘。第二天，将大约100颗萌发的种子均匀地播种到苗圃托盘中，并在达到三叶一心期时接种 (Wang et al. 2017)。在JA处理前，将孢子悬浮液冲洗过滤。分别在接种前6 h、接种期间和接种后72 h喷施低(100mu;mol/L)和高(400mu;mol/L)剂量JA。在三个JA处理组中，分别在接种后0h、24h、48h、72h、96h和120 h采集水稻叶片样品，立即冷冻于液氮中，并置于minus;80℃保存待进一步分析。采用标准分级和病害指数进行植物病理评估，结果如下(Xu 2002): 稻瘟病严重程度分为9个等级，分别为:(0)无病斑;(1)尖端小的棕色斑点;(2)略大的棕色斑点;(3)小而圆的褐色坏死斑;(4)典型梭形病变;(5)典型梭形病变，面积lt;10%;(6)典型梭形病变，面积10-25%;(7)典型梭形病变，面积26-50%;(8)典型梭形病变，面积51-75%;(9)枯叶皆死(Xu,2002)。

2.4内源性JA的测定

为了评估内源JA水平，在提取JA之前，将水稻叶片在无菌水中轻轻洗涤三次，在甲醇中浸泡。所有样品均用固相萃取柱(SPE-NH2，北京绿色百草科技发展有限公司，北京，中国)纯化，采用UPLC-MS/MS (Waters, Massachusetts, America)分析。

2.5qRT-PCR

使用Trans Zol UP (Trans Gen Biotech, Beijing, China)提取水稻总RNA，通过Trans Script All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix用于qPCR试剂盒(Trans Gen Biotech, Beijing, China)获得cDNA。采用Trans Start Top Green qPCR SuperMix (Trans - Gen Biotech, Beijing, China)对Bio-Rad iCycler (Bio-Rad, Beijing, China)进行qRT-PCR。反应周期和扩增方案按照前面的描述进行(Wang et al. 2017)。本研究应用的引物如表1所示。结果使用2^{minus;Delta;Delta;Ct}方法进行分析(Livak和Schmittgen 2001)。

2.6FDA / PI染色

二醋酸荧光素(FDA)(东京化学工业有限公司，日本)和碘化丙啶(PI) (Sigma-Aldrich，美国)分别溶于丙酮或水1-mg/mL的原液中。将2-mu;L FDA原液和10-mu;L PI原液混合于1 mL水中制备FDA/PI工作液。将水稻鞘的切片放置在幻灯片上，然后染色，并使用共聚焦系统(SPII5, Lecia，德国)进行观察。所有实验均进行了3次生物重复。采用SPSS26.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA)进行数据分析。数据是用Sigmaplot10绘制的。

2.7数据分析

所有实验均进行了3次生物重复。采用SPSS26.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA)进行数据分析。数据是用Sigmaplot10绘制的。

3结果

3.1JA在不同浓度下抑制M.o ryzae的生物学行为

JA被报道能够诱导植物的防御反应(Riemann et al. 2013);因此，我们假设JA可能影响M.o ryzae的产孢。用不同浓度的JA处理35S:MoSTD1/Mo-4和另一株(95234I-1b)后，我们发现高浓度的JA在处理后第5天显著抑制了M.o ryzae的菌落生长(图1a)。第14天，在显微镜下直接计数法测定产孢量。结果表明，JA浓度持续增加至3 mmol/L，而M.o ryzae的产孢量逐渐下降至0(图1b)。从孢子萌发和附着胞形成分析中也获得了类似的模式;外源JA可逐渐抑制种子萌发率和附着胞形成率(图1c, d)。总的来说，JA在不同浓度下都能抑制稻瘟病菌的生物学行为。

表1目的基因引物序列

图1 不同浓度的JA对M.o ryzae菌株5 d的生物学行为有抑制作用。测定生长速度(a)。第14天，计数孢子产生(b)。同时分析孢子萌发(c)和附着胞形成(d)。数值表示三次生物重复的平均值plusmn;SD。不同字母代表差异显著，P lt; 0.05

3.2外源JA可减轻稻瘟病的症状

为了进一步研究茉莉酸对水稻稻瘟病症状的影响，我们在LTH品种上进行了试验。经100~400mu;mol/L JA处理的LTH叶片鞘细胞经FDA/PI染色未见细胞损伤(图2a)。先用100mu;mol/L或400mu;mol/L JA预处理LTH叶片6 h，再用35S:MoSDT1/Mo-4或95234I-1b侵染。接种7 d后，测定稻瘟病症状及严重程度。与对照组相比，400mu;mol/L JA预处理可显著降低病变大小和病情严重程度(图2b)。其次，将含有100mu;mol/L或400mu;mol/L JA的35S:MoSDT1/Mo-4或95234I-1b孢子悬浮液喷到LTH上;我们再次观察到400-mu;mol/L JA处理对稻瘟病症状和严重程度的显著缓解作用(图2c)。最后一组实验中，将100-mu;mol/L或400-mu;mol/L JA溶液喷洒到已感染95234I-1b稻瘟病菌的LTH上，与对照组相比，100-mu;mol/L和400-mu;mol/L JA处理均能显著减轻稻瘟病症状。在实施的所有干预措施中，后一种方案的效果最好(图2d)。

3.3外源JA处理提高了水稻内源JA水平

外源刺激，如昆虫的食草性刺激，可以通过上调多个JA调控基因，导致JA在植物中的快速积累。在缺乏内源JA的情况下，植物的防御能力受到损害，可以通过应用外源JA来恢复(Cao et al. 2016)。然而，外源JA对其内源积累影响的潜在机制仍不清楚。本研究以100mu;mol/L或400mu;mol/L茉莉酸喷雾处理LTH叶片48h或96 h，测定茉莉酸水平。结果表明，100mu;mol/L茉莉酸喷施对LTH叶片JA含量的影响较小，而400-mu;mol/L茉莉酸喷施48h和96 h后，LTH叶片JA含量显著增加，达到2.09mu;g/g(图3)。

3.4JA上调水稻防御相关基因

上述表型促使我们进一步探索JA激发水稻稻瘟病防御反应的潜在机制。在100-mu;mol/L或400-mu;mol/L JA喷雾处理后的0h、24h、48h、72h、96h和120 h采集LTH叶片样本进行防御相关基因分析。100mu;mol/L外源JA显著上调OsPR10a的表达; 72 h诱导率最高，为5.64倍

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