类泛素蛋白Urm1在真核生物中的新兴作用外文翻译资料

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类泛素蛋白Urm1在真核生物中的新兴作用

摘要

Urm1蛋白首先在酿酒酵母中被发现，后来发现其在不同的真核生物中发挥重要作用。在类E1激活酶Uba4的帮助下，Urm1可以起到靶蛋白的修饰作用，称为urmylation。硫氧还蛋白过氧化物酶Ahp1是早期唯一确定的Urm1靶标。最近，还确定了许多其他Urm1靶标，这对我们充分了解urmylation的功能很重要。Urm1还可以作为硫载体在tRNA硫醇化中发挥关键作用。Urm1在蛋白质和RNA修饰中的机制在过去几年中得到了很好的揭示。Urm1的生物学和生理功能也在不同的生物体中被发现。在本次报告中，我们将总结这些新兴进展。

关键词 泛素相关修饰物；Urm1；urmylation；tRNA硫醇化；压力反应

1 介绍

蛋白质的翻译后修饰在调节真核生物的发育和细胞的过程中起关键作用。泛素和类泛素(UBLs) 具有相似的蛋白质结构特性（例如beta;-grasp球状折叠结构），并以相似的模式修饰靶蛋白。类泛素通常含有一个C端GG（甘氨酸-甘氨酸）基序，用于在其赖氨酸残基处与靶蛋白结合，通过该基序，它们依次使用E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶来完成修饰过程。在过去的几十年中发现了ISG15、Nedd8、SUMO、FAT10、ATG8、ATG12、HUB1等新型类泛素，包括Urm1。

Urm1首次在酿酒酵母中被报道，与其E1激活酶Uba4一起介导urmylation 途径。不同真核生物中的蛋白质BLAST和结构分析表明，Urm1-Uba4修饰系统类似于大肠杆菌MoaD-MoeB和ThiS-ThiF系统，分别参与硫胺素合成和钼蝶呤合成（图 1）。

图1 酿酒酵母Urm1、大肠杆菌MoaD、小家鼠Urm1和智人Urm1的结构图示。

MoaD-MoeB和ThiS-ThiF系统是原核硫载体，介导硫代羧酸盐的形成，为ATP依赖性硫化提供硫。在酿酒酵母中，Urm1修饰硫氧还蛋白过氧化物酶Ahp1，这是Urm1的经典靶标，并在氧化应激反应中起关键作用。有趣的是，还发现Urm1作为硫载体调节tRNA修饰。Urm1的双重作用在两篇评论论文中得到了很好的总结。在过去十年中，Urm1在更多生物体中的作用得到了揭示，通过蛋白质组学发现了更多Urm1靶标，并且Urm1如何调节蛋白质urmylation和tRNA硫醇化的机制也得到了很好的揭示。因此，在这篇综述中，我们将总结Urm1的新发现和已知发现，重点是介绍新的Urm1靶标、Urm1在蛋白质的urmylation、tRNA修饰、应激反应中的机制，以及它在不同生物体中的生物学和生理功能。

2 Urm1介导的蛋白质urmylation和tRNA修饰的分子基础

Urm1介导的urmylation在真核生物中高度保守，但与其他类泛素相比，Urm1的硫载体活性使其代表了真核生物类泛素和原核硫载体之间的进化连接子。酿酒酵母 Urm1的结构分析清楚地表明，该蛋白质含有beta;-grasp和其他结构，为蛋白质修饰和硫转移提供了分子基础（图1）。Urm1和MoaD之间的高度相似性表明它们具有相似的功能，包括与其他蛋白质的相互作用（图 1）。酿酒酵母Urm1的晶体结构表明，它在攻击和结合其底物之前形成同源二聚体，以保护C 端的高活性Gly残基。

在urmylation过程中，Urm1通过其N端结构域介导的腺苷酸化被特异性激活酶（E1）Uba4激活，同时硫转移到Urm1的C端。然后硫羧化活性Urm1 (Urm1-COSH) 进行蛋白质urmylation (图2)。Uba4-Urm1异二聚体复合物的晶体结构证实Uba4能很好地识别Urm1的C端并对其进行硫代羧酸化。Uba4有两个保守结构域，一个MoeB样结构域和一个C末端硫氰酸样结构域(RLD)。RLD结构域负责催化硫转移。MoeB样结构域和RLD结构域都含有一个半胱氨酸，负责在Cys225和Cys397处分别形成Urm1硫代羧酸盐和tRNA硫醇化。

图2 Urm1介导的蛋白质urmylation和tRNA修饰。硫的流动过程证明了Urm1系统组分介导Urm1结合过程和tRNA硫醇化(mcm⁵s²U₃₄的2-硫尿苷形成)的机制

整个urmylation途径的机制尚不清楚。除激活酶E1 (Uba4)外，在任何生物体中均未鉴定出Urm1特异性结合酶E2和连接酶E3，以及去urmylation酶。这导致根本不存在有Urm1特异性E2或E3的可能性，并且Uba4可以直接将Urm1转移到底物上。事实上，过硫化的Uba4可以在Urm1的C端形成硫代羧酸基团。然而，在E2和类泛素之间形成的通常是硫酯中间体而不是硫代羧酸盐。因此，Uba4是否直接将Urm1转移到底物上也是值得商榷的。

与泛素化不同，urmylation似乎不是聚合物修饰，因为在任何真核细胞中都没有发现聚合urmylation过程，而在古细菌的Urm1中可能存在这种情况。在大多数类泛素中，它们被表达为一种无活性的前体，在与底物结合之前需要蛋白酶切割。然而，Urm1直接表达为成熟蛋白，无需蛋白酶切割过程。是否是Urm1在蛋白质修饰和tRNA修饰中的双重功能使其与其他类泛素不同，这种现象仍然是一个谜。

如上所述，Urm1还负责尿苷(s2U34)的2-硫醇化（图2），这是一种对协调蛋白质翻译与合成至关重要的通用tRNA修饰。细胞内tRNA硫醇化水平的变化对于细胞对不同环境压力的反应很重要。Uba4激活的Urm1 (Urm1-COSH) 也可以被介导U34的2-硫醇化的关键成分识别。为了弄清楚Urm1如何调节 tRNA 修饰，不同的研究团队使用功能蛋白质组学筛选分析来识别Urm1介导的tRNA硫醇化所需的成分。例如，一些酵母蛋白，包括Urm1、Uba4、Nfs1、Tum1、Ncs6和Ncs2，被发现参与Urm1介导的tRNA 硫醇化（图 2）。Nfs1是一种半胱氨酸脱硫酶，在tRNA硫醇化的上游充当硫供体，将硫转移到下游的Tum1或Uba4。Tum1是一种硫代硫酸盐转移酶，它作为一种可选的过硫化物载体在硫氰酸样结构域的Cys259处接受来自Nfs1的硫。因此，过硫化物硫可以直接（通过Nfs1）或间接（通过Tum1）转移到 Uba4。然后Uba4与Urm1相互作用，在Urm1的C端形成酰基腺苷酸中间体，随后在Urm1 C端形成连接Uba4的酰基二硫键。最后，制备了硫羧化的Urm1 (Urm1-COSH)，作为下游tRNA修饰的硫供体，它还作为urmylation的蛋白偶联物（图 2）。通过使用Urm1-COSH作为底物，mcm⁵s²U₃₄（5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷）的 tRNA 2-硫醇化修饰被一种 Ncs6/Ncs2 异二聚体（图 2）硫解酶催化。但是，目前尚不清楚 Ncs6 是如何与Ncs2识别特定的tRNA并催化2-硫尿苷的形成。

3 Urm1 底物的鉴定

Ahp1（烷基氢氧化物还原酶I）是Urm1的第一个确定的修饰靶标，其直系同源物已在不同的生物体中发现，例如果蝇（名为Prx5）和真菌稻瘟病菌。Ahp1作为硫氧还蛋白过氧化物酶对氧化应激反应很重要。通过基于蛋白质组学的分析，在哺乳动物细胞、黑腹果蝇、利什曼原虫和古细菌酸热硫化叶菌中发现了大量 URM1 靶标。

在智人中鉴定出21种推定的Urm1底物，包括MOCS3（Uba4同源物）、ATPBD3（Ncs6同源物）和CTU2（Ncs2同源物），这些都被发现在氧化应激反应中起作用。MOCS3是钼辅因子生物合成所需的硫转移酶，而ATPBD3和CTU2是tRNA硫醇化所需的两种硫尿苷酶。这些数据表明Urm1可以修改其自身的应激反应途径。智人的其他Urm1靶标包括USP15和USP47（去泛素化酶）和CAS（细胞凋亡易感蛋白）。 在人类中，Urm1 底物在H₂O₂ 或二酰胺处理条件下增加，但两种处理条件下的底物不同。

在酸热链球菌（S. acidocaldarius）中，鉴定出29个Urm1结合物，这表明Urm1参与了20S蛋白酶体介导的蛋白质降解。例如，FBP蛋白的urmylation影响其靶向20S 核心蛋白酶体。在锥虫L. donovani中，通过使用alpha;-LdUrm1抗体联合质谱技术，还鉴定了许多推定的urmylated蛋白。有趣的是，在这些靶点中，有些是早期内体介导的囊泡运输相关蛋白（如rab-5、rab GTPase激活蛋白和液泡分选相关蛋白）。其他靶标还包括细胞骨架蛋白、E3连接酶RSP5以及HECT结构域蛋白。

在黑腹果蝇中也进行了亲和质谱分析，以识别推定的Urm1目标。从胚胎发生、幼虫阶段或成蝇样品中总共检测到79种Urm1相互作用蛋白，包括过氧还蛋白5 (Prx5)、tRNA 2-硫醇化蛋白Ncs6同源物和E1酶Uba4。其他重要的靶点包括GILT1（硫醇还原酶）、PHGPx（氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶）、MsrA（蛋氨酸亚砜还原酶）、Jafrac1（过氧化还原酶）、Ade5（氨基咪唑核糖核苷酸合成酶）和Cdk12（细胞周期蛋白依赖性激酶）。这些Urm1底物的蛋白质网络分析表明，除了tRNA修饰和氧化应激的功能外，urmylation还可能对免疫威胁和DNA损伤应激作出反应。

尽管在不同的生物体中发现了许多urmylation的靶标，但依附于Urm1的生物学后果在很大程度上是未知的。我们已经知道Ahp1的两个urmylation位点都位于氧化还原活性中心附近，这表明urmylation可能会干扰过氧化物酶Ahp1的活性，但这需要进一步确认。还需要确定urmylation是否影响目标在结构上的功能（例如，Ahp1 的二聚化）、酶活性、蛋白质相互作用等。

4 Urm1在应激反应中的机制

为了保护细胞免受毒性氧化应激，真核生物已经发展出不同的策略来对抗这些应激。URM1已被广泛证明在不同真核生物的氧化应激反应中发挥关键作用，如酿酒酵母、米霉、黑腹果蝇和智人。这些生物体中Urm1直系同源物的突变体以及Uba4直系同源物的突变体也对氧化剂敏感。Urmylation是由真核生物中的细胞内活性氧 (ROS) 和硫醇反应剂诱导的，重要的Urm1靶标包括氧化应激反应蛋白，如2-Cys过氧还蛋白Ahp1。但直到最近才知道Urm1如何调节氧化应激反应。研究表明，urmylated过氧化物酶Ahp1和tRNA硫醇化都有助于Urm1 在氧化应激反应中的作用。

氧化应激特异性地诱导酵母和人类细胞中的urmylation。在正常情况下，Urm1处于稳态条件下，大部分Urm1以硫代羧酸盐形式存在，而在硫醇氧化剂二酰胺条件下，Urm1硫代羧酸盐与靶蛋白结合。过氧还原酶作为硫醇依赖性氧化还原酶，在真核生物中高度保守，被细胞用来解毒ROS以实现氧化还原稳态。过氧还蛋白Ahp1优先用于解毒有机过氧化物，例如叔丁基过氧化氢 (tBOOH) 和二酰胺。通常，Ahp1作为同二聚体存在以形成疏水二聚化界面。组成型同二聚体形成是Ahp1抗氧化活性的先决条件，Ahp1形成一个基于两个催化半胱氨酸（Cys-31和Cys-62）的中心。Ahp1的Urmylation发生在两个赖氨酸残基Lys-32和Lys-156上，它们都靠近氧化还原活性中心。在氧化应激（尤其是t-BOOH）下，Cys-31和/或Cys-62的突变显着降低了Ahp1的urmylation水平，酵母细胞无法抵抗氧化应激（图3）。对于 Ahp1 同型二聚体，每个Ahp1亚基包含一个分解硫醇 (Cys-31:CR)和一个过氧化硫醇(Cys-62:CP)，用于解毒有机过氧化物。例如，对于t-BOOH的解毒，Cys-62:CP被亚磺酰化形成-SOH键，然后与Cys-31:CR 形成二硫键，该二硫键将被硫氧还蛋白（Trr1、Trx1和Trx2等）。

图3 Urm1介导的酵母过氧化物酶Ahp1的urmylation机制。在过氧化物条件下，Ahp1 Cys-SH（过氧化硫醇）形成 Cys-SOH（次磺酸），促进表面的暴露。然后次磺酸(CysSOH)与Urm1-COSH 缩合，活化的硫代羧酸盐形成 Urm1，并形成含有酰基二硫化物的 Ahp1-S-S-CO-Urm1。随后，Ahp1-S-S-CO-Urm1旁边的Lys残基对羰基进行亲核进攻，在每个单组分中形成Lys-NH-CO-Urm1形式。

Urm1介导的tRNA硫醇化在应对高温、内质网应激以及氧化应激方面也发挥着关键作用。tRNAs修饰通过响应不同的压力而改变。例如，高温会导致野生型酵母菌株中tRNA硫醇化的显着降低，从而赋予ER抗逆性。在压力条件下，Urm1通路不稳定并导致翻译减少。某些tRNA修饰也会在不同的发育阶段发生变化。例如，在酵母中，urm1Delta;突变体表现出较慢的生长和增加的Hsf1依赖性应激反应，以及翻译减少。有趣的是，URM1-tRNA硫醇化途径突变体更能抵抗高温等一些压力，这表明减少tRNA修饰会增加细胞对某些压力的耐受性。对于在升高的温度下生长的酵母野生型菌株，协调地降低了tRNA硫醇化水平。

总的来说，Urm1作为蛋白质修饰剂和tRNA修饰剂的双重作用，两者都将其功能与氧化应激反应联系起来。

5 Urm1及其同源物在原核和真核细胞中的功能作用

Urm1最初是在酵母中发现的，随后在不同的真核生物中发现了它的直系同源物，例如人类、黑腹果蝇、植物(拟南芥)和真菌(M. oryzae)（表1）。在功能上，Urm1直系同源物在所有这些生物体中都发挥着关键作用。我们还将讨论一些 Urm1 同源物在古细菌和细菌中的功能。

表1 不同生物体中的Urm1系统

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