1. 研究目的与意义
甾体类药物具有重要的生理活性,在临床上有广泛的应用,是仅次于抗生素的第二大类药物。目前甾体药物生产中常用的方法有化学合成和微生物转化两种,其中微生物转化法显示出其巨大的优势。分枝杆菌可降解植物甾醇生成系列代谢中间体,例如雄甾-4-烯-3,17-二酮(ad)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(add)、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-oh-ad)等,这些产物可作为前体用于制备临床甾体药物。
9α-羟基雄烯二酮（9α-oh-ad）因其化学结构上9-羟基的存在，其可在c9位方便引入一个卤素原子，如氟氯等，可用于合成数种高效含卤（氟，氯）糖皮质激素，是制备倍他米松及地塞米松等甾体类药物的重要中间产物之一。目前, 可通过两步及一步发酵法进行微生物降解获得9-oh-ad。两步发酵法是先将底物甾醇(谷甾醇、胆甾醇) 进行侧链降解, 制备获得ad后，再通过其他微生物(如诺卡氏菌、棒杆菌及红球菌属)对ad再进一步进行9位点羟基化获得9-oh-ad。一步发酵法即是利用微生物一步法直接发酵甾醇获得目标产物9-oh-ad。由于两步发酵法相对比较繁琐，因此9-oh-ad的主要生产方法是通过微生物的一步生产发酵获得。到目前人们相继发现细菌、酵母、放线菌、霉菌的某些菌种均可以利用甾醇将其转化为相应不同的甾体激素药物，如分枝杆菌、节杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、红球菌、诺卡氏菌等微生物，其中产9-oh-ad的主要为分枝杆菌。这些微生物广泛应用于甾体激素的生产，其与化学合成9-oh-ad工艺一起共同推动了甾体药物的工业化生产。在工业应用中,常使用谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等植物甾醇作为底物,通过分枝杆菌等菌种生物转化获得9α-oh-ad。在此过程中,3-甾酮-9α-羟基化酶（ksh）是生物转化植物甾醇为9α-oh-ad的关键酶,该酶由3-甾酮-9α-羟基化酶（ksh a）和3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶（ksh b）两个亚基构成。
同时9-oh-ad的生产还普遍存在着甾醇水溶性差、底物传质效率低、产物抑制以及产物降解等相关问题，研究者针对这些问题展开了相关实验探索。张怀成等以ppg2000、peg2o0以及多种硅油作为促溶剂对分枝杆菌hk86转化甾醇产9-oh-ad的促进效果进行了比较分析，筛选获得了优良的甾醇转化促进剂。高兴强等利用谷物油作为油相，建立了一种简单的油水乳化体系，并分析机械搅拌、分散剂（吐温80）以及油与植物甾醇的配比对形成稳定乳化体系的影响。在该油水乳化体系中，甾醇投料浓度和9-oh-ad产率得到了提高，进而提高了植物甾醇转化效率。xu等研究发现温度对于植物甾醇转化有着密切的联系，研究表明在37 ℃ 时能够抑制ad向add 转化，add向9-oh-add转化,温度控制在30-37℃ 之间，方便快捷地降低了母核的降解。尽管目前对植物甾醇转化9-oh-ad的研究日渐增多，但9-oh-ad的产量还未达到工业化要求，因此9-oh-ad高转化获取率仍是现在及其以后人类亟需解决攻克的问题。
2. 研究内容和预期目标
（1）预实验确定小试工艺流程，画出工艺流程图；
对实验室已有的分枝杆菌进行了原生质体紫外诱变的系统研究，确定了分枝杆菌原生质体制备条件，并比较了筛选得到的菌株制备生产9-oh-ad能力，获得了一株生产转化能力较好的菌株，最后用该菌株在5-l生物反应器中进行无油工艺转化制备9-oh-ad的初步研究。就分枝杆菌原生质体诱变菌株将植物甾醇转化为甾体药物代谢中间体9-oh-ad的无油工艺转化制备9-oh-ad进行了研究探索，通过转化制备条件优化以及对其代谢途径中关键酶kstd分析展开抑制剂一系列的实验探索，为甾体药物工业的发展及甾体药物中间体9-oh-ad环保无油工艺生产提供了理论基础。
（2）进行中试实验的物料衡算和热量衡算，确定相关参数；
3. 研究的方法与步骤
4. 参考文献
[1] 张怀成, 王风清, 马昱澍,等. 分枝杆菌转化甾醇产9α-羟基雄甾烯酮促进剂的筛选[j]. 化学与生物工程, 2013, 30(12):55-58.
[2] 高兴强, 冯建勋, 花强,等. 油水乳化体系中分枝杆菌转化植物甾醇产9α-羟基雄甾烯酮工艺研究[j]. 华东理工大学学报:自然科学版,2014,40(4):433-437.
[3] xu xw, gao xq, feng jx, et al. influence of temperature on nucleus degradation of 4-androstene-3, 17-dione in phytosterol biotransformation by mycobacterium, sp[j]. letters in applied microbiology, 2015, 61(1):63–68.
5. 计划与进度安排
（1）2022-2022-1学期17-20周~2022-2022-2学期第3周~第4周（2022-12-25~2022-3-23）
搜集的资料、调查的数据并进行整理分析，根据实验室已有的结果，确定开展小试验的工艺，并进行英文翻译。
（2）第5周~第8周（2022-3-26~4-20）
