1. 研究目的与意义
sumo是类泛素蛋白家族的重要成员之一,可与多种蛋白结合发挥相应的功能,其分子结构及sumo化反应途径都与泛素类似,但二者功能完全不同。sumo化修饰可参与转录调节、核转运、维持基因组完整性及信号转导等多种细胞内活动,是一种重要的多功能的蛋白质翻译后修饰方式。sumo化修饰功能的失调可能导致某些疾病的发生。
sumo蛋白分布广泛,存在于各种真核生物细胞中,在芽殖酵母、线虫、果蝇及培养的脊椎动物细胞中都有表达。但酵母、线虫、果蝇只存在一种sumo基因,而在植物和脊椎动物体内包含几种不同的sumo基因。人类基因组就编码了四种不同的sumo蛋白。
2. 研究内容和预期目标
本实验属于分子生物学中的基因重组内容，实验主要是对细胞内泛素蛋白家族的蛋白质进行基因重组然后对蛋白质在菌中进行表达，主要通过目标基因的扩增，载体质粒的酶切以及目标基因与载体进行连接，然后转入到细胞内进行培养，然后对其进行检测，确定所插入的基因准确无误，对其进行后续操作。
因此预期目标可以概括为以下几个方面的内容：1.查找文献，确定酵母细胞中所要研究的蛋白序列2.根据蛋白序列和所需要的载体序列设计蛋白质的引物序列3.提取酵母基因组，利用酵母基因组进行目标序列的扩增
3. 研究的方法与步骤
（一）酵母菌基因的分离和纯化
取1.5ml对数生长期的酵母菌，12000r/min离心1-2min，取沉淀溶于590ul se缓冲液中混匀加10ul溶菌酶（50mg/ml）,37℃，1h后，12000r/min离心8-10min，取沉淀溶于100ul蛋白酶k缓冲液，混匀37℃，1h，加入1.2ml的catb/nacl,200ul 20%pvp混匀 65℃，30min后与等体积酚/氯仿/异戊醇混合液混匀，12000r/min离心4-5min取上清液。
（二）目的基因与运载体结合
4. 参考文献
1.Chittur V. Srikanth , Smriti Verma. Sumoylation as an Integral Mechanism in Bacterial Infection and Disease Progression. Adv Exp Med Biol. 2017;963:389-408. doi: 10.1007/978-3-319-50044-7_22.2.Yang WS, Campbell M, Chang PC. SUMO modification of a heterochromatin histone demethylase JMJD2A enables viral gene transactivation and viral replication.PLoS Pathog. 2017 Feb 17;13(2)3.Lisa Dwane1, William M. Gallagher2, Tríona Ní Chonghaile3, Darran P. O’Connor1. THE EMERGING ROLE OF NON-TRADITIONAL UBIQUITINATION IN ONCOGENIC PATHWAYS. JBC. 20174.Najahisa Murakami. Keiko Imamura, et al. Proteasome impairment in neural cells derived from HMSN-P patient iPSCs. Molecular Brain. 2017; 10:75.Jin L, Shen K, Chen T, Yu W, Zhang H.SUMO-1 Gene Silencing Inhibits Proliferation and Promotes Apoptosis of Human Gastric Cancer SGC-7901 Cells.Cell Physiol Biochem. 2017 Feb 21;6.Pauws E, Stanier P.Sumoylation in Craniofacial Disorders.Adv Exp Med Biol. 2017;7.Zhang J, Chen Z, Zhou Z, Yang P, Wang CY.umoylation Modulates the Susceptibility to Type 1 Diabetes.Adv Exp Med Biol. 20178.Cao J, Courey AJ.SUMO in Drosophila Development.Adv Exp Med Biol. 20179.Elrouby N.Regulation of Plant Cellular and Organismal Development by SUMO.Adv Exp Med Biol. 2017;963:227-247.10.Scurr LL, Haferkamp S, Rizos H.The Role of Sumoylation in Senescence.Adv Exp Med Biol. 2017;963:215-226.
5. 计划与进度安排
本试验主要利用蛋白质重组技术将泛素蛋白sumo基因插入到氨苄青霉素抗性的质粒中，然后对蛋白质进行体外表达并纯化的过程，因此本试验的内容主要包括一下几个方面： 目标基因的扩增，酶切 ；目标基因插入到载体中 ；目标基因的表达 ；目标蛋白的纯化 。因此根据本试验的内容，我们安排一下实验进度：3月2号-3月30号 目标基因的扩增，酶切，插入及检验4月1号-4月15号目标基因的蛋白表达及检验4月16号-4月30号目标蛋白的纯化5月1号-6月1日数据整理及毕业论文的撰写
