1. 研究目的与意义
1、目的：利用基因工程技术使嗜热凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶能够在大肠杆菌中表达，生产耐高温的乳酸脱氢酶。
2、意义:将大肠杆菌生长周期短、代谢易于控制、营养要求粗放的优点成功应用于工业生产；能够高效生产乳酸，解决市场上乳酸供不应求的现状。
2. 国内外研究现状分析
生产乳酸脱氢酶的大部分为乳酸菌、霉菌，研究者通过筛选食品和土壤等样品中的芽孢杆菌，分离纯化得到136株菌株，经过培养和镜检，再筛选到12株菌株，比较其产乳酸脱氢酶的活力，其中bj07活力最强，其细胞破碎液的酶比活为0.26u/mg。经过形态和生理生化鉴定，初步确定bj07菌株为枯草芽孢杆菌，研究其生物学特性，测定该菌株的生长曲线，其最适温度为34℃[2]。
生产乳酸的微生物种类很多，但与大肠杆菌相比，有周期长、营养要求高等缺点。若能利用大肠杆菌生长周期短、代谢易于控制、营养要求粗等优势进行生产乳酸脱氢酶，将会会有很好的应用前景。然而大肠杆菌本身不含有l-乳酸脱氢酶基因，不能生产乳酸。随着基因工程技术的不断发展，很多科学家利用基因重组技术将l-乳酸脱氢酶基因导入到大肠杆菌中，使其能够生产l-乳酸。
有研究者利用乳酸片球菌l-乳酸脱氢酶基因克隆，并在大肠杆菌中表达。采用pcr技术，以乳酸片球菌基因组dna为模板，克隆得到l-乳酸脱氢酶基因，将该基因的orf连接到表达质粒pet-22b（ ），获得重组质粒pet-ldhl。将pet-ldhl质粒转化大肠杆菌bl21株，实现了ldhl基因的表达；对含有ldhl基因的重组菌株进行表达研究，在30℃以tptg诱导8h后，sds-page分析可见明显特异性条带，酶活力达到6.49u/ml，是野生菌酶活力的2.3倍。对重组表达的l-乳酸脱氢酶生物学特性研究显示，他们的最适反应温度为27-30℃，最适反应ph为5.0-5.3[9]。
3. 研究的基本内容与计划
第1~2周写开题报告
第3~4周建立乳酸脱氢酶酶活分析测定方法
考察乳酸脱氢酶的最适反应温度、ph和底物浓度
4. 研究创新点
虽然已有利用重组大肠杆菌生产L-乳酸的研究，但本实验是第一次将嗜热凝结芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因克隆，转化到大肠杆菌中，使其生产的乳酸脱氢酶能在高温条件下催化生产L-乳酸。在医药、化工、轻工和聚乳酸生产等行业中都将有更加广泛的应用前景。
