1. 研究目的与意义
柚皮素为芸香科柑橘属植物中的一种多羟基黄酮类化合物，药理研究表明，柚皮素具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗溃疡、抗血栓和扩张血管作用。柚皮素在自然界中主要以柚皮苷的形式存在，虽然来源广泛，但是柚皮素在植物中含量通常很低。目前，柚皮素的提取方法主要有植物提取法、化学合成法、生物制备法。主要的植物提取法包括超声波辅助提取法、碱提酸陈法、溶剂萃取法、微波辅助提取法等，但是目前这些方法提取的柚皮素含量普遍较低，而相较于化学法存在安全性的问题，生物法比较安全。为了提高柚皮素的产量，能够为大规模工业化生产提供基础，采用体外植物来源酶进行体外催化的途径，能够更快更易控制柚皮素的生成。
2. 国内外研究现状分析
柚皮素为芸香科柑橘属植物中的一种多羟基黄酮类化合物，广泛存在于柑橘类水果、葡萄柚、西红柿等中。药理研究表明，柚皮素具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗溃疡、抗血栓和扩张血管作用。由于柚皮素具有多种药理活性，因此在食品、医药等领域被广泛应用。虽然来源广泛，但是柚皮素在植物中含量通常很低。目前，柚皮素的提取方法主要有超声波辅助提取法、碱提酸陈法、溶剂萃取法、微波辅助提取法等。
3. 研究的基本内容与计划
1、通过查阅文献，确定出目前已报道的具有较高酶活的4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合成酶（CHS）和查尔酮异构酶（CHI）。随后对筛选植物来源的4CL、CHS和CHI酶基因，进行密码子优化，完成植物酶在大肠杆菌体内的有效异源表达。 2、不同来源的4CL的最适反应条件及催化能力的酶活比较 3、不同来源的CHS的最适反应条件及催化能力的酶活比较 4、不同来源的CHI的最适反应条件及酶活催化能力的比较 5、筛选出最适合来源的4CL、CHS和CHI，体外组合构建柚皮素催化路线 将3种酶进行体外组合催化制备柚皮素，进行最适反应条件的最佳优化，高效制备柚皮素。 1周，查阅文献资料，了解研究内容，对实验涉及仪器、操作方法有一定了解； 2周，掌握的基本实验技能，制定一套实验方案；3-13周，按照研究内容逐步进行实验；14-16周，整理实验数据，撰写论文。 |
4. 研究创新点
在植物体内，主要通过苯丙烷合成途径生成黄酮类化合物。4-香豆酰辅酶 A 连接酶(4CL)以对香豆酸为底物进行催化，能得到对香豆酰辅酶 A。对香豆酰辅酶 A 在查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)的依次作用下，转化为柚皮素。由于柚皮素具有多种药理活性，因此在食品、医药等领域被广泛应用。目前通过提取法制备柚皮素途径并不能满足市场需求，而生物酶催化制备柚皮素的方法可以解决提取法制备柚皮素的的低产量和化学法制备柚皮素的安全性问题。本课题通过筛选植物来源酶来进行体外多酶催化制备柚皮素，进而满足市场需求和生产过程中安全性的问题，体外多酶催化与发酵的方法相比具有反应速率高，产量高，产物易分离等优点。 |
