1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
意义:血清白蛋白是血液中含量最多的蛋白质。
它有分子量小、结构稳定的特性,具备贮运内源代谢产物和外源性小分子等重要生理功用,关于药物的药理药效施展具备重要作用。
大量文献表明,牛血清白蛋白关于研讨小分子体内代谢,确定药物的药代动力学和药效方面的性质,目前是最理想的蛋白模型。
2. 研究的基本内容和问题
项目研究目标及主要内容: 对黑果枸杞这一珍贵的药材中的含量最高的一种花色苷进行提取,获得该花色苷的纯品。
研究该花色苷与牛血清蛋白(bsa)生物大分子的结合作用,应用荧光色谱、紫外吸收光谱等方法对bsa与该花色苷的相互作用的淬灭作用类型、淬灭常数、表观结合常数、结合位点点数、结合空间距离、结合过程中热力学参数等机理参数进行研究,该研究能够提供黑果枸杞花色苷与bsa结合作用的基本信息,为黑果枸杞应用于药物筛选和与蛋白质作用规律提供佐证。
拟解决的关键问题:目前尚不能确定纯化后的花色苷是否能与bsa结合,需通过预实验进行验证。
3. 研究的方法与方案
(1)取黑果枸杞干以1:40料液比用体积分数80%乙醇(含0.1%甲酸)在50℃条件下水浴浸提3 h ;(2)将步骤(1)得到的离心上清液加入到旋蒸瓶中旋蒸,旋蒸温度控制在45℃,旋蒸至较浓稠的紫黑色液体;(3)将步骤(2)的旋蒸液加10 ml上样于用AB-8大孔树脂填充的层析柱(530cm);(4)将步骤(3)所得带有颜色的收集液集中到旋蒸瓶中旋蒸,旋蒸温度为40℃,旋至较浓稠的紫黑色液体,用0.1%的TFA溶液稍加稀释;(5)将步骤(4)得到的旋蒸液过膜,通过高速逆流色谱法进行纯化,高效率的提取LRM单品花色苷。
(6)将步骤(5)所分离出的样品旋蒸,冷冻干燥即为高纯度的矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷;(7)将(6)所得到的花色苷纯品与BSA在不同温度(10℃,20℃,37℃)条件下结合30min, 于荧光光谱仪、紫外可见光光度计上检测,研究该花色苷是否与BSA结合,并研究其结合方式,得到淬灭常数、表观结合常数、结合位点点数、结合空间距离、结合过程中热力学等试验参数,阐述结合机理。
4. 研究创新点
目前,多酚与蛋白质的相互结合受到了研究者们的热切关注,涉及的领域也较为广泛。
提取黑果枸杞中含量最高的一种花色苷,通过与bsa的结合试验能模拟出该花色苷与人体血液的结合情况,可为药物筛选提供很高的参考价值,在此前人们对于黑果枸杞的了解并不多,关于此方面的论文数量也较少。
而改进了实验室原有的方法,采用高速逆流色谱法可以更高效率的提取样品,相比akta purifier蛋白纯化系统能提高纯化效率5倍以上。
5. 研究计划与进展
阅读国内外相关文献,规划讨论形成最终实验方案,总结实验关键点。
提前准备好黑果枸杞(原料)并将其放置在-18℃保存。
熟悉掌握akta purifier蛋白纯化系统、荧光色谱仪,紫外色谱仪傅里叶红外光谱等仪器设备,对所在院系没有的仪器提前到相关单位预约,保证实验顺利按时完成。
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