酵母葡聚糖的分离纯化工艺研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、本课题的意义 1,3-β-d-葡聚糖是一种极富生物活性的多糖，它表现出很强的刺激免疫和抗肿瘤活性,是一种良好的生物反应调节剂[1]。

1,3-β-d-葡聚糖还能够改善食品的质地，可以用作食品中的增稠剂、脂肪的替代物，能够在肉制品中作为持水持油剂，并可作为食品中膳食纤维的来源，是一种非常优良的食品添加剂[2~4]。

啤酒酵母细胞壁中含有的 30%~60% β-葡聚糖（干重），是最好的活性免疫多糖之一。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标：本课题主要目的是从啤酒酵母中提取出β-1,3-d-葡聚糖，并尽量提高其产率，先选择单因素，再进行正交试验，得出获得产物的最佳条件。

2、研究内容：主要有：1、啤酒酵母活化；2、菌体自溶；3、加酶酶解或热水浸提；4、酶与产物分离。

5、产物脱水，烘干。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法：同时采用自溶法和自溶-酶法制备酵母葡聚糖。以啤酒酵母为原料，实验一利用菌体在水中自溶的特性使菌体细胞壁破碎得粗制品，实验二在自溶处理后用木瓜蛋白酶分解细胞壁中蛋白质，离心得到β-1,3-D-葡聚糖精制品。对比两者产物得率。

2.技术路线：实验一：酵母菌悬液 → 自溶 → 离心 → 葡聚糖粗制品 → 乙醇、丙酮、乙醚洗涤 → 烘干 → 测定

实验二：酵母菌悬液 → 自溶 → 木瓜蛋白酶处理 → 离心 → 乙醇、丙酮、乙醚洗涤 → 烘干 → 测定

3.实验方案：

3.1 前期试验：

实验一：自溶-热提法（1）、配制酵母菌悬液 称取5g干酵母，按g：ml=1:20的料液比用100mL蒸馏水配制成菌悬液。（2）菌体自溶 将上述菌悬液置于50℃摇床恒温，搅拌自溶24h。（3）热水浸提上述液体80℃保温20min，5000 r/min离心10min，用乙醇、丙酮、乙醚各洗涤一次，干燥得葡聚糖粗制品。

实验二：自溶-酶解法（1）、配制酵母菌悬液 称取5g干酵母，按g：ml=1:20的料液比用100mL蒸馏水配制成菌悬液。（2）菌体自溶将上述菌悬液置于50℃ 摇床恒温，搅拌自溶6h。（3）酶解按20000U/g干酵母的加酶量，在上述溶液中加入0.25g木瓜蛋白酶。50℃摇床恒温18h后，4 5000 r/min离心15min，得到沉淀，用乙醇、丙酮、乙醚各洗涤一次，干燥得葡聚糖精制品。

3.2 后期测量：产物得率、多糖和蛋白质含量测定。

产物得率=（干燥后产物质量原料质量）100%

多糖含量采用苯酚-硫酸比色法，测定蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250法。

3.2.2 多糖含量测定

①制作标准曲线：准确称取105℃烘干至恒重的葡萄糖10mg于100ml的容量瓶中配制成0.1 mg/ml的标准溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管，补水至1ml，分别配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/ml的溶液。分别加入 5% 苯酚溶液1 ml，并迅速加入浓硫酸5 ml（加入试剂的量见下表），静置10 min。摇匀，30℃放置30 min后于490nm测定OD值，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。

管号	1	2	3	4	5	6
葡萄糖标准液（ml）	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
蒸馏水（ml）	1.0	0.8	0.6	0.4	0.2	0
5%苯酚溶液（ml）	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
浓硫酸（ml）	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0

② 样品含量测定：将干燥样品溶于100ml水，稀释500倍，制得样品液。吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作于490nm测定OD值，并代入标准曲线计算样品的葡聚糖含量。

3.2.2 蛋白质含量测定

①制作标准曲线：准确称取牛血清白蛋白10mg，用蒸馏水溶解后定容至100ml，配制成0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。配制考马斯亮蓝G-250染色液。取6只试管，分别加入0、0.2、0.40、0.6、0.8、1.0ml标准蛋白质溶液，补水至1ml。加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂（加入试剂的量见下表），震荡混匀，2分钟后于595nm测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

② 样品含量测定：将干燥样品溶于100ml水，稀释100倍，制得样品液。吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作于595nm测定吸光值，并代入标准曲线计算样品的蛋白质含量。对比上述两组实验最终的多糖得率、多糖含量、蛋白质含量，结合实验中的经费投入等因素，选择合适的实验方法。

3.3 单因素实验，优化酵母葡聚糖的提取工艺。

3.3.1 方法一：自溶-热提法选择的单因素：自溶时间、自溶pH值、热提温度。

按3.1 中实验一：自溶-热提法，仅将自溶时间改为4h、8h、12h、18h、24h、30h，其他条件不变，得到产物，按3.2中方法测定产物得率、多糖得率以及蛋白质含量。

按3.1 中实验一：自溶-热提法，仅将自溶pH改为3、5、7、9，其他条件不变，得到产物，按3.2中方法测定产物得率、多糖得率以及蛋白质含量。

按3.1 中实验一：自溶-热提法，仅将热提温度改为60℃、70℃、80℃、90℃，其他条件不变，得到产物，按3.2中方法测定产物得率、多糖得率以及蛋白质含量。

3.3.2 方法二：自溶-酶解法选择的单因素：酶解时间、酶解温度、酶解pH

按3.1 中实验二：自溶-酶解法，仅将酶解时间改为4h、8h、12h、18h、24h、30h，其他条件不变，得到产物，按3.2中方法测定产物得率、多糖得率以及蛋白质含量。

按3.1 中实验二：自溶-酶解法，仅将酶解pH改为3、5、6、7、9，其他条件不变，得到产物，按3.2中方法测定产物得率、多糖得率以及蛋白质含量。

按3.1 中实验二：自溶-酶解法，仅将酶解温度改为45℃、50℃、55℃、60℃，其他条件不变，得到产物，按3.2中方法测定产物得率、多糖得率以及蛋白质含量。

3.4 三因素三水平正交实验

3.4.1方法一：自溶-热提法；正交表如下

	自溶时间（h）	自溶pH	热提温度（℃）
A1	4	5	70
A2	4	7	80
A3	4	9	90
B1	6	5	80
B2	6	7	90
B3	6	9	70
C1	8	5	90
C2	8	7	70
C3	8	9	80

分别测定A1A9样品的产物得率、多糖含量以及蛋白质含量。

3.4.2 方法二：自溶-酶解法正交表如下

	酶解时间（h）	酶解pH	酶解温度（℃）	热提温度（℃）
A1	10	5	50	70
A2	10	7	55	80
A3	10	9	60	90
B1	12	5	55	80
B2	12	7	60	90
B3	12	9	50	70
C1	14	5	60	90
C2	14	7	50	70
C3	14	9	55	80

分别测定A1A9样品的产物得率、多糖含量以及蛋白质含量。

得到两种实验方法的最佳条件，并综合实验的经济投入、产物效益等因素，选择合适的实验方法。

4、可行性分析：主要运用一些基本实验方法，操作简单，需要的条件也较容易达到，原料和试剂购买方便，价格适中，符合经济效益最大化要求。实验所需器材基本都为实验室常用仪器试剂，实验室已基本具备。

4. 研究创新点

目前细胞壁多糖提取已经在工厂生产阶段，但多糖提取大多采用酸法或碱法，有害物质排放较多，对环境危害大，而且不符合国家相关规定。

本实验避免在实验中使用酸碱，不使用化学方法，减少有害物质排放，做到清洁生产，不使用物理方法，减少电能等能源消耗，降低成本，符合经济效益最大化原则，可以扩大到工厂生产，乙醇、丙酮、乙醚洗涤后可回收，提高试剂利用率。

5. 研究计划与进展