1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1. 课题意义、应用前景
我国为产茶大国，有丰富的天然资源。茶水是备受人们喜爱的饮料之一，与人们的生活息息相关，茶叶作为中华民族的传统保健饮料已有四五千年的历史。茶叶中含有多种活性成分，其中茶多酚（儿茶素）、茶氨酸和茶多糖这三大提取物已得到广泛的重视[3]。黑茶中主要活性成分为茶多酚，约占黑茶干重的10%~30%，其中儿茶素占60-80%，而表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）约占到儿茶素的50%。现代研究证明，茶多酚不仅是一种新型的天然抗氧化剂，具有保鲜、防腐、降解、无毒副作用，食用安全，还具有明显的抗衰老，消除人体过剩的自由基，去脂减肥，降低血糖、血脂和胆固醇，预防心血管疾病，抑制肿瘤细胞等药理功能[4-6]。与此同时，还有防治艾滋病， 防龋护齿，抑制口臭等作用。还有助于预防和治疗辐射伤害，有助于抑制和抵抗病毒菌，有助于美容护肤，抗过敏，防腹泻，抗流感，增强免疫力，解烟毒等多种功效。所以在食品加工、医药、日用化工等领域具有重要的应用[15]。
黑茶的降血糖血脂功效是当今国内外的研究热点问题。人体脂防代谢失调、过多积累就会引起肥胖。黑茶中丰富的茶多酚等多种有效成分能明显抑制体内胆固醇、甘油三脂(均为血脂主要成分)含量的上升，能去脂，解油腻，阻碍胆固醇的消化和吸收，促进胆固醇排泄。常饮黑茶可以帮助人体提高4~6%的代谢效率，让减肥、 降脂的效果倍增[8]。另一方面，脂肪的消化吸收分为消化过程和吸收过程，消化是吸收的前提，而人体中控制脂肪消化分解的酶为胰脂肪酶。因此，本课题提出相应实验假设：黑茶中多酚类成分能有效抑制胰脂肪酶的活性从而抑制脂肪消化吸收来达到减肥的效果。同时，通过荧光猝灭实验深入探究黑茶茶多酚对胰脂肪酶的结构的影响，进一步阐述多酚类成分对胰脂肪酶的作用机理。本课题通过研究黑茶多酚类成分分析及其对胰脂肪酶活性的影响，将为黑茶多酚类物质发挥更大的经济价值提供理论和实验依据。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标： 此次研究以黑茶为原料，通过树脂吸附分离法提取得到茶多酚样品并且通过福林酚法检测该样品中多酚类成分含量。同时，通过抑制动力学研究来确定茶多酚对胰脂肪酶的抑制作用，深入研究半抑制浓度、抑制类型和可逆性抑制类型等酶动力学参数。通过荧光猝灭实验深入探究黑茶茶多酚对胰脂肪酶的结构的影响。 研究内容： (1) 通过树脂吸附分离法，研究茶多酚的分离纯化方法，得到茶多酚样品。 (2) 通过福林酚法检测样品中多酚类成分含量。 (3) 研究茶多酚对胰脂肪酶的抑制作用，确定抑制动力学参数半抑制浓度、抑制类型和可逆性抑制类型。 (4)通过荧光猝灭实验，研究黑茶茶多酚对胰脂肪酶的结构的影响，从而探讨活性与结构的关系。 拟解决的关键问题： (1) 茶多酚样品的制备与纯度提高。 (2) 样品中多酚类成分含量测定。 (3) 酶动力学实验。 (4) 荧光猝灭实验。 |
3. 研究的方法与方案
研究方法： (1) 通过热水浸提法对茶叶中多酚类有效成分进行提取，利用树脂吸附分离法得到茶多酚样品。 (2) 利用福林酚法得到高相关性没食子酸标准曲线，通过测量茶多酚样品的吸光值得到样品中多酚类成分含量。 (3) 采用非连续测定和作图法研究茶多酚对胰脂肪酶的抑制作用，确定其半抑制浓度、抑制类型和可逆性抑制类型。 (4)用黑茶多酚类物质猝灭胰脂肪酶的蛋白质内源性荧光，得到荧光猝灭图。 |
技术路线与实验方案：
（1）黑茶茶多酚样品的提取
（2）多酚类成分分析：福林酚法测量多酚含量。
（3）茶多酚对胰脂肪酶的作用
i.茶多酚对胰脂肪酶半抑制浓度的确定：改变茶多酚抑制剂的浓度，胰脂肪酶和底物的浓度不变进行反应，通过测量反应物的吸光值来求出抑制活性，进行多元非线性拟合，利用回归方程求出茶多酚的半抑制浓度。其中抑制活性计算公式为：
抑制率(%)=[(T1-T2)/T1]100%
式中T1和T2分别代表无抑制剂和有抑制剂时的酶活。
ii. 茶多酚对胰脂肪酶抑制类型的确定：固定茶多酚的浓度不变，在一系列不同的酶浓度下测定反应吸光值，绘制抑制动力学曲线。
iii. 可逆性抑制类型的研究：固定酶浓度和茶多酚浓度不变，在一系列不同的底物浓度下测定反应吸光值，通过双倒数作图法判断其具体抑制类型。
(4) 荧光猝灭实验
以不同浓度梯度的黑茶茶多酚溶液作为荧光猝灭剂，选取线性浓度范围内的胰脂肪酶溶液做荧光猝灭实验。在20℃，pH 6.9条件下，用荧光分光光度计分别对酶溶液、PBS缓冲液和样品进行扫描3D荧光光谱图，确定激发波长（λex）和发射波长（λem）。分别在20℃和37℃，pH 6.9 条件下，将一定浓度的样品溶液加入到酶溶液中，反应1min后进行3D荧光光谱扫描，并在确定的激发波长（λex）和发射波长（λem）处测定相对荧光强度，绘制浓度与相对荧光强度的函数关系图。
可行性分析： 理论可行 (1) 本项目申请前，项目组进行了大量的预备研究工作，并广泛查阅并深入分析了现有的文献资料，建立了主要的试验和研究方法。根据我们现有资料与前期研究工作，我们认为本项目基于的理论正确与可行。 (2) 实验方法与技术可行 本项目拟采用的实验技术和实验方法主要有荧光光谱分析技术、树脂吸附分离技术、酶标仪分析技术、NMR分析技术等，这些实验方法与技术手段已在我们的研究工作中得到应用，因此本项目的实验方法与技术是可行的。 (3) 实验条件可行 本实验所在的实验室经验丰富，且小组成员均已对该实验的相关内容有了较深的了解，且导师与助教的资历很深，可以有助于我们顺利达到此次研究的目的。 |
4. 研究创新点
本实验的创新之处在于将茶叶发挥的生理性功能作用具体到茶叶中不同的功能性物质上，进行提取纯化，得到高纯度的物质。当前科学界对黑茶茶多酚的研究并不多，然而其生理作用却很有利，例如可以抗氧化，减肥，降血脂等等。同时，茶多酚在体内对胰脂肪酶的作用等也日益得到重视。此课题对茶多酚的生理作用进行研究，从而更进一步对茶叶中营养物质进行全面细致的探讨，加深对茶叶中生物有效成分的研究力度。 |
5. 研究计划与进展
2013年10月11月：查阅相关文献，进一步了解有关实验过程中的理论和方法，设计实验并准备实验。 2013年11月12月：通过热水提取法对茶叶中多酚类成分进行提取，利用树脂吸附分离法，旋蒸浓缩、冻干得到茶多酚样品。 2014年2月3月：利用福林酚法得到高相关性没食子酸标准曲线，检测样品中多酚类成分含量。提交中期检查报告。 2014年3月4月：采用非连续测定和作图法研究茶多酚对胰脂肪酶的抑制作用，确定其半抑制浓度、抑制类型和可逆性抑制类型。 2012年4月5月：优化利用树脂吸附分离法，得到高含量茶多酚样品，确定茶多酚对胰脂肪酶的抑制作用以及半抑制浓度、抑制类型和可逆抑制类型。进行荧光猝灭实验。 2013年5月6月：进行数据的整理，并撰写论文，课题总结与验收 |
