1. 研究目的与意义
天冬氨酸酶（aspartase/asp）是一种氨基酸解氨酶（amino acid ammonia lyase, al），生产中用于以富马酸为底物制备天冬氨酸，具有无需辅酶和氨基供体廉价多样等优点。在生物催化法制备手性胺化合物的常见催化剂中，转氨酶具有底物范围广泛的优点，但其催化反应常由于平衡反应或副产物难以分离等问题，只有极少数工业化应用的例子；氨基酸脱氢酶被用于规模化生产l-叔亮氨酸和l-2-氨基丁酸等非天然氨基酸，但需要氧化还原辅酶循环，氨基供体也限制为氨水；单按氧化酶目前只能用于拆分，而亚胺还原酶不但需要辅酶循环系统，还不能制备目前用途最广的伯胺，这两者尚无工业化应用的报道。因此，开发氨基酸解氨酶为催化剂的合成路线对生物法生产手性胺化合物具有重要意义。
土壤可作为一个巨大的天然微生物库，这些微生物在自然界的进化中形成了独特的性质和催化能力。绝多数的化学反应中所需的酶类催化剂，都可以在土壤微生物中发现。土壤微生物易于培养，作为工业开发时，利用廉价易得的复合培养基，可以对土壤微生物进行大规模筛选、培养和长期保藏，简便易行，经济环保。
土壤中蕴含丰富的微生物资源，天冬氨酸酶在微生物中分布广泛，从微生物中筛选出具有新特性和高活力的天冬氨酸酶，是一项非常有意义的工作。根据文献报道，天冬氨酸酶通常在偏碱性环境下发挥较高的活力，因此本次实验计划经过初筛培养、富集培养和发酵优化培养，筛选出在偏碱性环境下产天冬氨酸酶活力较高的菌株，并对目标菌株产天冬氨酸酶最佳培养条件进行了初步研究，以期为扩大天冬氨酸酶的生产源提供基础资料。
2. 研究内容和预期目标
对于高产天冬氨酸酶土壤微生物的筛选是本论文第一部分研究工作的重点。首先采用富集培养的方法对土壤产天冬氨酸酶的菌株进行初步筛选，找到富含天冬氨酸酶的目标菌株库。第二部分工作室对初筛获得的菌种进行复筛，从中选择产酶最高的菌株。第三部分的工作内容是对筛选出的菌株经行了初步鉴定，通过16srdna的方法获得所筛菌株的分类学信息。最后对酶活力最高的菌株进行优化培养，筛选出最优发酵培养基组成，以期为扩大发酵规模提供资料。
本研究的预期目标是获得几株高产天冬氨酸酶的细菌，另外一个现实的目标是为生物工程教学提供天冬氨酸酶的可靠来源。
3. 研究的方法与步骤
本课题的目的是土壤中高产天冬氨酸酶微生物的筛选并进行产酶优化。由于产天冬氨酸酶菌株广泛存在与土壤微生物中，采集富含目的菌株的土壤，用天冬氨酸为唯一碳源的方法进行初筛，培养48h后，观察平板上的长出的菌株。
初筛出来的目的菌株，接种环挑单菌落到富集培养基上，进行富集培养。将获得的菌体加入天冬氨酸酶，并检测其转化为富马酸的能力。采用分光光度计检测反应液od240的数值，从初筛获得的菌株库中选出最优的菌株。
对筛选出来的菌株，提取其总dna，利用通用引物进行pcr扩增其16srdna，送测序公司进行测序，将获得的序列在ncbi数据库中进行比对，获得分类学信息。
4. 参考文献
[1] prier ck, zhang rk, buller ar, brinkmann-chen s, arnold fh. enantioselective, intermolecular benzylic c–h amination catalysed by an engineered iron-haem enzyme. nature chem. 2017, 9: 629-634.
[2] wang j, ilie a, yuan s, reetz mt. investigating substrate scope and enantioselectivity of a defluorinase by a stereochemical probe. j. am. chem. soc. 2017, 139: 11241–11247.
[3] turner nj. ammonia lyases and aminomutases as biocatalysts for the synthesis of alpha-amino and beta-amino acids. engineering the third wave of biocatalysis. curr. opin. chem. biol. 2010, 15: 234–240.
5. 计划与进度安排
1. 2022-12-20～2022-1-20接受任务、查阅和翻译文献、撰写及完成开题报告
2. 2022-2-25～2022-3-25完成初筛、复筛，选定最佳菌株
3. 2022-3-25～2022-4-25完成最佳菌株的鉴定
