1. 研究目的与意义
NEDD8是近年发现的一种泛素样小分子蛋白，是最重要的类泛素样蛋白之一，其与底物蛋白的结合过程称为neddylation。Neddylation修饰与肿瘤细胞的增值，转录因子的调控等高度有关。
NEDD8修饰系统对细胞增殖、发育有重要作用,但NEDD8的靶蛋白目前仅发现P53、Mdm2、pVHL和Cullin家族。目前已知，NEDD8主要通过修饰Cullin蛋白而调控Cullin-RING E3连接酶的活性，进而参与到细胞周期调控、转录与信号传导等生物学过程。寻找更多的 NEDD8靶蛋白成为目前研究的热点。
2. 研究内容和预期目标
本实验属于分子生物学中的基因重组内容，实验包括目标基因的获取以及目标基因的扩增和重组表达，因此具体可以概括为以下几个方面的内容：1.查找文献，确定酵母细胞中所要研究的蛋白序列2.根据蛋白序列和所需要的载体序列设计蛋白质的引物序列3.提取酵母基因组，利用酵母基因组进行目标序列的扩增4.纯化目标序列，将目标序列插入载体中5.将重组的质粒转入到大肠杆菌中进行表达
3. 研究的方法与步骤
（一）目的基因提取1. 新鲜的菌体中加入150ul（200ul）bufferii25(30)ul蜗牛酶（30mg/ml），37度，10min（可以30min水浴，中间隔5分钟，振荡一次，避免细胞沉到管底。
2. 离心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入bufferii250ul3. 加入25ul，10%sds。
65度，30min水浴。
4. 参考文献
1.He S, Cao Y, Xie P, Dong G, Zhang L.The Nedd8 Non-covalent Binding Region in the Smurf HECT Domain is Critical to its Ubiquitn Ligase Function. Sci Rep. 2017 Feb 7;7:41364.2.Paiva C, Godbersen JC, Rowland T, Danilova OV, Danes C, Berger A, Danilov AV. Pevonedistat, a Nedd8-activating enzyme inhibitor, sensitizes neoplastic B-cells to death receptor-mediated apoptosis. Oncotarget. 2017 Feb 3.3.Tan KL, Pezzella F.Inhibition of NEDD8 and FAT10 ligase activities through the degrading enzyme NEDD8 ultimate buster 1: A potential anticancer approach.Oncol Lett. 2016 Dec;12(6):4287-4296.4.Paiva C, Godbersen JC, Rowland T, Danilova OV, Danes C, Berger A, Danilov AV.Pevonedistat, a Nedd8-activating enzyme inhibitor, sensitizes neoplastic B-cells to death receptor-mediated apoptosis.Oncotarget. 2017 Feb 3.5.Bonacci T, Audebert S, Camoin L, Baudelet E, Iovanna JL, Soubeyran P.Regulation of NUB1 Activity through Non-Proteolytic Mdm2-Mediated Ubiquitination.PLoS One. 2017 Jan 18;12(1):e01699886.Mergner J, Kuster B, Schwechheimer C.DENEDDYLASE1 counters automodification of neddylating enzymes to maintain NEDD8 homeostasis in Arabidopsis.J Biol Chem. 2017 Jan 17.7.Onel M, Sumbul F, Liu J, Nussinov R, Haliloglu T.Cullin neddylation may allosterically tune polyubiquitin chain length and topology.Biochem J. 2017 Feb 20;8.Rulina AV, Mittler F, Obeid P, Gerbaud S, Guyon L.Distinct outcomes of CRL-Nedd8 pathway inhibition reveal cancer cell plasticity.Cell Death Dis. 2016 Dec 19.Malhab LJ, Descamps S, Delaval B, Xirodimas DP.The use of the NEDD8 inhibitor MLN4924 (Pevonedistat) in a cyclotherapy approach to protect wild-type p53 cells from MLN4924 induced toxicity.Sci Rep. 2016 Nov 30;6:37775.10.Pai CS, Khuat LT, Chen M, Murphy WJ, Abedi M.Therapeutic Effects of a NEDD8-Activating Enzyme Inhibitor, Pevonedistat, on Sclerodermatous Graft-versus-Host Disease in Mice.Biol Blood Marrow Transplant. 2017 Jan;23(1):30-37.
5. 计划与进度安排
本试验主要利用蛋白质重组技术将泛素蛋白NEDD8基因插入到氨苄青霉素抗性的质粒中，然后对蛋白质进行体外表达并纯化的过程，因此本试验的内容主要包括一下几个方面： 目标基因的扩增，酶切 ；目标基因插入到载体中 ；目标基因的表达 ；目标蛋白的纯化 。
因此根据本试验的内容，我们安排一下实验进度：3月2号-3月30号 目标基因的扩增，酶切，插入及检验4月1号-4月15号目标基因的蛋白表达及检验4月16号-4月30号目标蛋白的纯化5月1号-6月1日数据整理及毕业论文的撰写
