1. 研究目的与意义
小麦是小麦系植物的统称，是单子叶植物，是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物。小麦是一种温带长日照植物，适应范围较广，小麦的颖果是人类的主食之一，小麦也是中国最重要的口粮之一，小麦产业发展直接关系到国家粮食安全和社会稳定。
盐碱化土壤分布非常广泛，据统计，盐溃土约占世界土地总面积的10％。盐分是影响植物生长和产量的一个重要环境因子，高盐会造成植物减产或死亡。盐碱化土壤导致土地产出率低,农业综合生产能力严重不足，成为制约农民增收的主要因素。
2. 研究内容和预期目标
盐分和高温都是影响农作物生长的胁迫因子，盐分与高温双胁迫使农作物生长受到抑制，甚至可能引起农作物死亡。钙不仅是植物必须的矿质营养元素之一,而且对于维持细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白的稳定性,调节无机离子运输,作为细胞内生理生化反应的第二信使偶联胞外信号起重要作用。当植物受到逆境胁迫时, 胞内游离ca2 常常显著增加,这种增加可以启动基因表达,激活一系列生化反应,使植物能够适应环境胁迫。
通过模拟小麦在盐分高温胁迫下的生长环境，选择小麦幼苗期作为实验时段，用一系列浓度梯度的ca2 对盐分低温双胁迫小麦幼苗进行处理，然后测定以下生理指标：株高、叶绿素含量、脯氨酸含量、mda含量、可溶性糖含量。以盐分高温双胁迫下小麦幼苗的指标为对照，分析ca2 在小麦幼苗盐分低温双胁迫过程中的作用。
3. 研究的方法与步骤
1、株高的测定
测定株高将结果填入下表
| 株高/cm | 20℃ | 35℃ | 35℃ 0.05mol/L NaCl | ||
| 0.05mol/LNaCl | 10mmol/L Ca2 | 30mmol/L Ca2 | 50mmol/L Ca2 | ||
| 1d |
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2、叶绿素含量的测定
实验步骤：①取新鲜小麦的叶片，用叶绿素仪测定小麦叶尖的叶绿素含量，并记录。
②将结果填入下表
| 叶绿素/SPAD | 20℃ | 35℃ | 35℃ 0.05mol/L NaCl | ||
| 0.05mol/LNaCl | 10mmol/L Ca2 | 30mmol/L Ca2 | 50mmol/L Ca2 | ||
| 1d |
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3、硝酸还原酶活性的测定——活体法
原理：作为植物氮素代谢作用中的关键性酶--硝酸还原酶，它作用于NO3-使其还原为NO2-，产生的NO2-从组织内渗透到外界的溶液中，然后积累在外界的溶液中。测定反应液中的NO2-增加可表现硝酸还原酶的大小。在酸性溶液中，NO2-可与磺胺生成重氮盐，然后与α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料。
实验步骤：①将新鲜取回的小麦叶片清洗，大概用蒸馏水洗涤3次，然后用吸水纸吸干，吸干残余的水分后于天平上称取等重的叶子两份，每份约0.3～0.4g，用剪刀剪碎后小麦叶片后，将其分别置于含有下列溶液的50mL三角烧瓶中：（1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）5mL 蒸馏水5mL；（2）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）5mL 0.2mol/LKNO35mL。将准备好的三角烧瓶放于于真空泵抽气，抽气时间为30min,放气后，叶片即会沉于溶液中。然后将三角烧瓶置于30℃下避光保温30min，时间结束后再分别吸取三角烧瓶中的反应液1mL于试管中，用来测定NO2－的含量。
②NO2－含量的测定：保温30min结束后，吸取三角烧瓶中的反应液1mL于一试管中，再加入磺胺试剂2mL和α-萘胺试剂2mL，摇匀后静置30min，最后用分光光度计在520nm进行测定，记下OD值。按照标准曲线上读出NO2－含量，再计算酶活力，以每小时每克鲜重产生的NO2－μg或μmol表示。
③标准曲线的制作：分别吸取0.5、1、2、3、4、5μg/mL各个浓度的NaNO2溶液1mL于各试管中，然后在试管中加入磺胺试剂2mL和α-萘胺试剂2mL，摇匀静置30min（或者30℃水浴保温30min），结束后立即于分光光度计520nm下测定OD值。以OD值为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标，绘制OD-浓度曲线。
④将结果填入下表
| OD（520nm) | 20℃ | 35℃ | 35℃ 0.05mol/L NaCl | |||||||
| 0.05mol/LNaCl | 10mmol/L Ca2 | 30mmol/L Ca2 | 50mmol/L Ca2 | |||||||
| 缓冲液 水 | 缓冲液 KNO3 | 缓冲液 水 | 缓冲液 KNO3 | 缓冲液 水 | 缓冲液 KNO3 | 缓冲液 水 | 缓冲液 KNO3 | 缓冲液 水 | 缓冲液 KNO3 | |
| 1d |
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⑤计算
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样品中酶活性（μg·g-1·h-1）= | C× | V1 |
| V2 | ||
| W×t |
式中：
C——反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg）
V1——提取酶液时加入的混合液体积（mL）
V2——酶反应时加入的粗酶液体积（mL）
W——样品重
t——反应时间（h）
4、脯氨酸含量的测定
原理：酸性条件下，茚三酮会与脯氨酸的发生反应，产生红色化合物的含量与色度呈正比，可以用分光光度计测定，此法有专一性。
实验步骤：①取新鲜小麦叶片0.5g，用剪刀剪碎后置于研钵中，加入5mL 3％磺基水杨酸研磨提取，研磨成匀浆后，转移至离心管中，再在沸水浴中提取10min，待匀浆冷却后于3000r/min离心10min，取2mL上清液于试管中待测。
②制作标准曲线：用100μg/mL脯氨酸配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/mL的标准溶液。取各个浓度标准溶液各2mL具塞于试管中，再加3%磺基水杨酸2mL，冰醋酸2mL和2.5%酸性茚三酮试剂4mL，盖塞后在沸水浴中显色1h，显色结束冷却后加入甲苯4mL，将各个试管于漩涡混合仪上振荡0.5min，等待试管中的溶液静置分层，分层后吸取上层红色甲苯相，在分光光度计波长520nm处测定OD值。最后以OD值为纵坐标，脯氨酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。
③各取2mL上清液，分别加入蒸馏水2mL，冰醋酸2mL和2.5%酸性茚三酮试剂4mL，同上述制作标准曲线的步骤一样进行显色、萃取和比色，最后从标准曲线查得脯氨酸含量。
④将结果填入下表
| OD520nm | 20℃ | 35℃ | 35℃ 0.05mol/L NaCl | ||
| 0.05mol/LNaCl | 10mmol/L Ca2 | 30mmol/L Ca2 | 50mmol/L Ca2 | ||
| 1d |
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⑤计算
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| C× | V |
| 脯氨酸含量（μg/g）= | A | |
| W |
C为从标准曲线上查得的脯氨酸含量（μg/mL）；V为提取液总体积（mL）；A为测定时的提取液体积（mL）；W为样品鲜重（g）。
5、丙二醛（MDA）含量和可溶性糖含量的测定——硫代巴比妥酸法
原理及方法：植物在逆境下，经常发生膜脂过氧化作用，其产物之一就是丙二醛（MDA），可表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境反应的强弱。
酸性和高温条件下，丙二醛（MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）发生反应后生成棕色的物质，这种物质在532nm处有最大吸收波长，但可溶性糖会在很大程度上干扰该反应。所以要排除可溶性糖的干扰，通常做法是加入低浓度Fe3=。来显著增加硫代巴比妥酸与糖的显色反应。用双组分光光度计法能分别求出丙二醛和可溶性糖的含量。
实验步骤：①MDA的提取：取新鲜的小麦叶片0.5g，将其剪碎于研钵中，加入少量石英砂和1mL 10%三氯乙酸（TCA）初步研磨，进一步加入4mLTCA充分研磨成匀浆，匀浆液以4000r/min离心10min,离心后的上清液即为样品提取液。
②显色反应及测定：吸取2mL提取液，加入0.6%TBA溶液2mL，混匀后加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min,迅速冷却后再次离心。取上清液测定532nm和450nm处的OD值，空白对照管2mL蒸馏水代替提取液。
③将结果填入下表
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| 20℃ | 35℃ | 35℃ 0.05mol/L NaCl | |||||||
| 0.05mol/LNaCl | 10mmol/L Ca2 | 30mmol/L Ca2 | 50mmol/L Ca2 | |||||||
| OD532nm | OD450nm | OD532nm | OD450nm | OD532nm | OD450nm | OD532nm | OD450nm | OD532nm | OD450nm | |
| 1d |
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④计算：C1/（mmol/L）=11.71OD450
C2/（μmol/L）=6.45OD532－0.56OD450
式中：C1为可溶性糖的浓度；C2为MDA的浓度[11]⑤结果分析
4. 参考文献
[1]潘瑞炽.植物生理学[m]北京:高等教育出版社,2004.
[2]张宝译.盐胁迫下不同的钙盐对小麦幼苗耐盐性的影响[j].植物学报,1997(4):49-51.
[3]孟婧,朱祥春,史芝文,等.cacl2浸种对玉米幼苗双胁迫抗性的研究[j].东北农业大学学报,2007,38(2):149-152.
5. 计划与进度安排
1.2022-12-25选题，接受任务；
2.2022-12-26—2022-03-6完成开题准备；
3.2022-02-29—2022-03-4上交开题报告；
