1. 研究目的与意义
除D-葡萄糖等少数单糖外，多数自然界中存量稀少的单糖及衍生物被称“稀有糖/稀少糖”（rare sugars）。我国糖尿病患者超过一亿，肥胖人口数量也位居世界第一，稀有糖具有高甜度、低热量等特性，是良好的代糖，也可用于制备活性药物成分。现阶段，稀有糖主要由酶催化等生物技术方法制备。D-核糖-5-磷酸异构酶（D-ribose-5-phosphate isomerase, Rpi, EC 5.3.1.6）底物范围广泛，可催化四至六碳底物，是制备稀有糖的主要工具之一。Rpi的应用潜力推动了其分子改造工作，但迄今取得的进展有限。首先，常见宿主如大肠杆菌含有干扰重组酶测活的野生型糖异构酶及糖代谢中间体，易错PCR等依赖高通量筛选的方法难以开展；尝试敲除宿主野生型Rpi的工作结果也不理想。其次，进化压力下Rpi结构保守，与底物结合作用单一（氢键）活性中心残基常具有多种功能，理性设计改造活性中心的策略空间有限。
酶与底物的结合机制是近年来酶工程的研究热点。对于底物中的极性带电基团，通常可以由结合位点残基通过电荷作用进行结合，极性非带电基团可以通过极性相互作用进行结合，并且都可以将远距离的氨基酸残基通过诱导效应发挥作用。本研究拟探索源自苍白杆菌（Ochrobactrumsp.）的核糖-5-磷酸异构酶A（ribose-5-phosphate isomerase A, OsRpiA）的底物范围性质。我们已经报道了OsRpiA具有广泛的底物范围，包括D-核糖-5-磷酸, D-阿拉伯糖, D-阿落塘, L-核糖 和L-鼠李糖等。从糖异构酶的研究来看，底物范围是最重要的特性之一，通过实验研究底物范围是最有效的手段，但是受到成本、时间等多方面因素限制，不可能对所有的稀有糖均进行测试。因此，本实验的目的是通过生物信息学手段分析OsRpiA的底物谱，找到其底物结合和催化反应的规律，并对其可能的底物进行预测。通过虚拟突变与实验突变的结合，利用同源建模、分子对接和生物信息学等方法进行研究，找到糖异构酶家族的底物反应特性，并为利用糖异构酶进行生物法稀有糖制备的工作奠定基础。
2. 研究内容和预期目标
本实验拟对来自苍白杆菌（Ochrobactrumsp.）CSL1的核糖-5-磷酸异构酶OsRpiA对D-阿洛糖的反应机理进行研究。首先根据其三维结构信息设计突变位点，随后使用SWISS-MODEL 在线服务器进行OsRpiA突变体蛋白质三维结构建模，对获得的结构进行评估和优化，得到较为准确的蛋白结构。利用较为准确的蛋白结构与D-阿洛糖进行分子对接，对得到的结果进行分析，并以最优突变体作为出发点进行下一轮突变和对接。通过上述工作。获得能够高效催化D-阿洛糖反应的蛋白质序列，为OsRpiA的实际分子改造探索可行道路
3. 研究的方法与步骤
一、分子建模采用swiss- model服务器（http://swissmodel.expasy.org/），通过序列搜索获得覆盖率和相似度较高的模板，以该模板产生三维结构，对所产生结构的评价采用拉氏图进行，对所产生结构的优化采用moe软件中的amber ff10力场进行。
二、蛋白结构与底物的对接前准备、对接过程及对接结果采用ucsf chimera软件进行（具体对接程序为autodock vina）。
三、对接结果的分析采用pymol软件进行。
4. 参考文献
[1] eisenbenberg david, marcotte, edward m,et al .proteinfunction in the post-genomic era[j].nature, 2000,405(6788):823-826.
[2] barker wc, garavelli js, huang h, et al. the proteininformation resource (pir) [j]. nucleic acids research,2000,28(1):41-44.
[3] harger c,chen g,farmer a,huang,w.the genome sequence database[j].nucleic acids research,2000,28(1):31- 32.
5. 计划与进度安排
1 2022 11-2022 12 查阅文献，撰写开题报告和前言
2 2022 01-2022 02 完成虚拟突变和对接筛选
3 2022 03-2022 04 根据筛选情况完成第二轮和第三轮突变和筛选工作
