1. 研究目的与意义
新饲料杂志(2006)报道了来源于国家863高技术课题的β-甘露聚糖酶生产技术的情况，指出甘露聚糖类物质是自然界中半纤维素的第二大组分，在饲料原料中分布广泛，对畜禽是一种抗营养因子。甘露聚糖酶能水解甘露聚糖类物质生成甘露寡糖，对动物的生长发育具有一系列积极作用。(1)促进动物生长，提高动物的饲料转化效率； (2)促进饲料消化，改善动物肠道微生物生态，改善动物体的健康状况；(3)降解甘露聚糖类物质，降低消化道内容物粘度，减少粪便排泄，减轻环境污染； (4)可以提高微量元素的生物利用率； (5)其降解产物甘露寡糖可促进动物肠道有益菌的生长； (6) β-甘露聚糖酶及其降解产物甘露寡糖可正向刺激机体免疫活性，增强机体地免疫力； (7)降解产物甘露寡糖还能够吸附真菌毒素，减少抗生素等化学药物的使用。
β-甘露聚糖酶(endo-1，4β-mannanase)是一种新型的酶制剂，属于一种半纤维素酶类，它除具有一般非淀粉多糖(nsp)酶类的作用一降解nsp，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收外；近来很多研究表明，β-甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂，因为它可以促进类胰岛素生长因子igf-i的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率。
β-甘露聚糖酶作为工具酶在糖工程、糖结构分析、植物基因工程等生物基础研究中有着重要用途, 利用β-甘露聚糖酶水解复杂糖类或糖蛋白的糖链中常有β-甘露糖苷键, 并测定水解产物中多糖类物质的种类和比例, 可以对天然多糖类物质糖链结构进行分析。因此研究甘露聚糖酶的酶解工艺有强烈的现实意义。
2. 国内外研究现状分析
早在上世纪初就有关于分解植物甘露聚糖的报道，但直到七十年代，β-甘露聚糖酶的研究才逐渐深入起来。尤其是近几十年来对半纤维素资源的开放和甘露聚糖益生价值的发现，以及β-甘露聚糖酶诸多用途的发现，大大推动了β-甘露聚糖酶研究的发展。1958年，courtios第一次报道了能产生β-甘露聚糖酶的真菌。1960年，william和doetsch报道了细菌产生的β-甘露聚糖酶。1965年，reese和shibata提出了β-甘露聚糖酶的概念和定义，为以后的研究打下基
础。七十年代后，大量β-甘露聚糖酶的产生菌株被筛选、诱变，研究培养基成分特别是碳源对酶产生的影响，进行多糖结构的分析。同时，许多不同来源的β-甘露聚糖酶被分离纯化，对酶的基本性质的研究取得了较大发展。上世纪九十年代的研究已证明，经甘露聚糖酶水解甘露聚糖产生的低聚糖为功能性糖类，在胃肠中不能被消化，但可以被人体和动物体肠道中的有益细菌双歧杆菌吸收，促进其增殖，而抑制有害菌生长，由此改善肠道内菌群组成，增进消化系统能，维护机体健康。因此，自九十年代以后，甘露聚糖酶及其酶法制取低聚糖的应用性研究引起人们极大关注。
β-甘露聚糖酶在畜禽养殖业中的研究应用很有前景，在美国，对产蛋母鸡来说，玉米一豆粕型日粮是最普通的日粮类型，因为豆粕含有β-甘露聚糖和它的衍生物如β-半乳甘露聚糖和β-甘露聚糖葡甘露聚糖，添加β-甘露聚糖酶可以改善豆粕的利用率。daskiran等(2004)报道，β-甘露聚糖能显著降低肉鸡的生长速度和增加料肉比。随后daskiran等(2004)又做了进一步的研究，表明β-甘露聚糖酶通过降解β-甘露聚糖改善了肉鸡的料肉比和减少了水料比及干粪排出量。wu等(2005)研究了β-甘露聚糖酶对饲喂玉米一豆粕型日粮商业来亨鸡生产性能的影响，研究结果表明：饲喂低能量补充β-甘露聚糖酶日粮组的总平均饲料转化率与饲喂高能量日粮组相似，两组均显著低于饲喂低能量不加β-甘露聚糖酶日粮组。β-甘露聚糖酶的添加提高了玉米一豆粕型蛋鸡日粮的能量利用率；在降低含有β-甘露聚糖的蛋鸡日粮成本方面具有很大的潜力。同时指出还需要进行更多的研究去确定β-甘露聚糖酶在饲料中的最适宜添加水平，以使产蛋母鸡获得最佳的生产性能和最大的利润。
3. 研究的基本内容与计划
利用基因重组技术将优化合成的甘露聚糖酶基因连接毕赤酵母ppiczαa诱导表达启动子之下，通过酵母诱导表达获得大量高酶活、耐热性能稳定的优质工业甘露聚糖酶。
将基因重组后的毕赤酵母进行4-6小时的活化，用活化液划平板，于30℃恒温箱培养24天以期长出单菌落。用牙签沾取单菌落接种于装25mlbmgy培养液的250ml三角瓶中，30℃，220rpm的摇床增值1618h，使细胞od值在26之间。收集细胞，15003000xg,离心5min,倒出上清悬细胞颗粒使od为1.0，在100mlbmmy培养液中诱导表达，进行产酶，每隔24h甲醇至最终浓度为12％。每隔12小时转移1ml培养液至1.5ml离心管里，分析产酶表达，通过测酶活确定最佳产酶时间。
进行扩大培养，在最佳产酶时间点收集酶液，进行离心收集上清液即粗酶液。β-甘露聚糖酶一般以胞外诱导酶形式存在于生物体中只有很少的以结构酶形式存在, 因此对于胞外酶目前一般采用将发酵后去除菌体的酶液先用硫酸铵盐析或有机溶剂沉淀, 再用离子交换柱层析、分配柱层析和亲和层析等方式分级处理。
4. 研究创新点
甘露低聚糖是β-甘露聚糖酶作用于多糖类物质后产生的功能性低聚糖, 这种低聚糖可有效地降低人体胆固醇水平, 降低血糖; 有利于人体或动物肠道有益菌群(双岐杆菌、乳酸菌)的生长, 抑制有害菌的繁殖, 从而改善人体肠道功能; 降低病原菌的致病力; 结合吸收外源性病原菌; 调节机体免疫系统, 增强动物以及人体免疫力。利用重组甘露聚糖酶酶解甘露聚糖产生低聚糖，将为大量生产低聚糖提供方便。
甘露低聚糖是唯一能结合肠道中外源性病菌的新型功能性低聚糖，广泛存在于魔芋粉、瓜尔豆胶、田菁胶及多种微生物细胞壁内。甘露低聚糖除了具有功能性低聚糖的特点外，还具有防治高血脂、抗氧化、增强免疫功能等作用。近年来，随着人们的生活水平的不断提高，低聚糖越来越受到消费者的青
睐，甘露低聚糖作为一种较优秀的新型低聚糖，也将会越来越受到人们的关注。
