1. 研究目的与意义
研究的目的：
本研究拟采用来源于thermotogathermarumα-葡糖糖醛酸酶在e.colibl21（de3）中诱导表达，采取不同的表达载体进行重组表达，以期获得高效表达α-葡糖糖醛酸酶的重组菌，并对该酶的酶学特性进行分析。
研究的意义：
2. 国内外研究现状分析
目前，影响木质半纤维资源生物转化的主要问题在于半纤维素降解酶的生产效率和以及其复杂的降解酶系配比，由于异源木聚糖是高度分支的多糖，其主链和侧链含有不同的侧枝，如果葡萄糖醛酸酶与内切木聚糖酶同时存在时，它们相互促进，加速低聚糖的产生，同时低聚糖也需要经α-葡萄糖醛酸酶去除4-o-甲基葡萄糖醛酸侧枝后才能被β-木糖苷酶彻底降解，因此，α-葡萄糖醛酸酶是木聚糖降解酶系中非常重要的一员。但是葡萄糖醛酸酶在自然界出现不多，而且活性不高，因此直到1986年该酶才有报道。目前，只有少数几个酶被纯化和定性，经过基因克隆和分析的就更少了。纯化的α-葡萄糖醛酸酶是分子质量为100kda左右的大分子蛋白质，采用的纯化技术主要为阴离子交换柱层析、疏水作用层析和凝胶过滤。第一个α-葡萄糖醛酸酶是从嗜热真菌（t.aurantiacus）中利用deae-sephadex离子交换柱层析和凝胶过滤纯化的，该酶能以相同的速度从聚合木聚糖和低聚糖释放4-o-meglca。目前所研究的α-葡萄糖醛酸酶大多数只能作用4-o-meglca取代的低聚糖或小型底物。因此，大部分α-葡萄糖醛酸酶需要同水解主链的木聚糖酶一起协同作用以便从木聚糖释放出相当量4-o-meglca的。但是t.sp，a.tugingensis和p.chrysosporium中的α-葡萄糖醛酸酶对聚合木聚糖也有少量活性，来自t.aurantiacus中的是这些纯化酶中对聚合木聚糖作用活性最高的。第一个从细菌中纯化的α-葡萄糖醛酸酶是来自嗜热厌氧细菌t.sp.jw/sy485，它是通过阴离子交换柱层析和疏水作用层析纯化得到的。该酶存在于细胞内，对于低聚木糖上的葡萄糖醛酸侧枝有较高的活性。
迄今为止，α-葡萄糖醛酸酶是木聚糖侧枝分解酶中报道最少的。在真菌和细菌中只有四个α-葡萄糖醛酸酶及其基因进行了分子水平的研究。t.maritima中编码的α-葡萄糖醛酸酶基因glr1长2541bp，编码847个氨基酸。一个假定信号肽序列的切割位点被确定在距离起始密码子的19个氨基酸处。成熟蛋白有828个氨基酸，与siika-aho等人报道的纯酶分子质量91-kda相同。氨基酸序列上有8个糖基化位点。ruilep等从t.maritima基因文库中通过α-葡萄糖醛酸酶活性筛选法得到6.5kb的基因组dna，并对其进行核酸序列分析、缺失实验及在大肠杆菌中表达，最后分离到一个编码674个氨基酸的α-葡萄糖醛酸酶基因，重组酶的凝胶过滤纯分子质量大于630kda，最适ph值6，最大活性温度为85℃。接着，devriesrp等从a.tubingensis2菌中纯化到一个胞外α-葡萄糖醛酸酶，经内切蛋白酶处理和反相hplc分离后，得到7个末端和中间肽并对其进行n-端测序；根据测得的氨基酸序列设计合成9条简并引物，分别以a.tubingensis基因组dna为模板进行pcr，获得一个1142bp的α-葡萄糖醛酸酶基因的部分片段，然后以该片段作探针从a.tubingensis的基因组文库中筛选到α-葡萄糖醛酸酶的完整基因。该基因含有一个2523bp的阅读框，编码着841个氨基酸的蛋白质，并含有一个20个氨基酸的真核信号肽。最近，choiid等又从b.sterothermophilus中克隆到α-葡萄糖醛酸酶基因并测序。他们是根据b.sterothermophilus、t.maritima和a.tubingensis个菌中的α-葡萄糖醛酸酶基因的保守序列设计合成了两个简并引物，经pcr扩增到一个638bp的pcr产物用作探针，通过southern杂交筛选到一个带有α-葡萄糖醛酸酶基因的克隆子。该基因含有一个2073bp的开放阅读框，编码691个氨基酸多肽。由氨基酸序列分析，t.reesei的glr1，t.maritima，b.sterothermophilus和a.tubingensis的agea相互间具有明显的同源性，属于糖基水解酶第67族家族。
已有研究者将这个菌的木聚糖酶基因xynb和α-葡萄糖醛酸酶基因agua构建基因工程菌，但其表达水平很低，因此，构建高效表达极耐热性α-葡萄糖醛酸酶的基因工程菌具有一定的应用前景。
3. 研究的基本内容与计划
研究内容:
本研究拟采用来源于thermotogathermarumα-葡糖糖醛酸酶在e.colibl21（de3）中诱导表达，采取不同的表达载体进行重组表达，以期获得高效表达α-葡糖糖醛酸酶的重组菌，并对该酶的酶学特性进行分析。
实验计划：
4. 研究创新点
α-葡萄糖醛酸酶作为木聚糖降解的限速酶之一，在木聚糖类半纤维素的生物转化中起着重要的作用。通过此种方法得到的α-葡萄糖醛酸酶具有优良的耐热性，具有非常可观的工业应用前景。
