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1. 研究目的与意义

1 研究的目的及意义

随着基因工程技术的飞速发展，更多的基因工程药物从实验室走向应用并造福人类，在生物制药,疾病治疗方面有了越来越重要的作用。科学研究表明，一些困扰人类健康的主要疾病，例如心脑血管疾病、糖尿病、肝病、癌症等都与基因有关。目前已有数十种蛋白类药物应用于临床治疗当中，上百种重组蛋白药物已进入临床研究。诸如重组大肠杆菌表达生产人干扰素，白细胞介素和人生长激素以及集落刺激因子等。在工程菌的发酵中，外源基因高表达条件下的发酵对于提高生产效率、降低生产成本、简化产品纯化工艺以及降低扩大生产投资都具有非常重要的意义。

2. 国内外研究现状分析

2 文献综述

2.1 外源基因在大肠杆菌中的表达

用于基因表达的宿主种类：①重组质粒转化到带有染色体t₇ rna聚合酶基因的大肠杆菌中，这些菌株都是噬菌体 de3的溶原菌，噬菌体 de3是一种衍生噬菌体，带有噬菌体 21抗性区和 laci基因，lacuv5 启动子，以及t₇ rna聚合酶基因。几种常用商业克隆载体都带有t₇启动子和单独的lac操纵子/启动子元件用于重组子的蓝/白斑筛选。这些载体上的多拷贝lac操纵子会结合lac抑制因子，使 pet 菌株中同样受lac抑制因子控制的基因部分表达。结果基本的t₇ rna聚合酶活性会升高，使目的基因的稳定性受到影响。②蛋白酶缺陷型 所有 b型菌株，b834，bl21，blr，origami b，rosetta 及tuner 都缺乏纯化过程中降解蛋白的 lon 蛋白酶及 ompt 外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在这些菌株中的稳定性要高于带有这些蛋白酶的菌株。bl21(de3)是用得最多的表达菌。③tuner 及其衍生菌(origami b和rosetta) 是 bl21 lacy1 删除突变的衍生菌，能够使整个培养体系中的细胞蛋白表达水平受到均一的调节。lac 透性酶(lacy1)突变使iptg均一渗透到所有细胞中，以获得浓度依赖的、均一水平的诱导。④ 带有谷胱甘肽还原酶(gor)突变和/或硫氧还蛋白还原酶(trxb)突变的菌株(ad494，bl21trxb，origami，origami b，rosetta-gami)都能增加细胞质中的二硫键形成。ad494 (de3)和 bl21trxb (de3)具有trxb突变，而origami (de3)，origami b (de3)和 rosetta-gami (de3) 菌株带有 trxb 和 gor 双突变。拥有 trxb 和gor 突变的菌株比单具 trxb突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。⑤rosetta 菌株是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有 trna水平，这些蛋白的表达会大幅度提高。⑥b834菌株是一种甲硫氨酸缺陷型菌株，也是 bl21的亲本。b834适合用于高效特异活性 35 s-met标记和硒代甲硫氨酸标记的结晶学研究。已经用b834(de3)表达了好几种目的蛋白，产量明显高于 bl21(de3)，显示了这种亲本在某些方面仍具有一些优势。

外源基因包括原核基因和真核基因，其中原核基因能够直接在大肠杆菌中表达。原核基因表达手段：①转化表达菌株；②de3溶原菌的诱导。需要具备以下条件：①增加蛋白溶解性及折叠②稀有密码子③毒性基因及质粒稳定性。

3. 研究的基本内容与计划

3.1研究内容

1.外源基因的克隆

2.外源基因小试表达条件的探究

4. 研究创新点

外源基因在大肠杆菌的表达是现代基因工程产业化的关键问题，研究提高外源基因在大肠杆菌中表达效率的工作已进行的十分广泛，被发现的影响表达效率的因素也有很多,它们之间有很大的相关性，单单改进其中一个方面往往不能取得明显的效果,有时还存在一定的机遇性。

基因的表达过程是一个复杂的过程,涉及基因的转录、翻译、翻译后加工、细胞的代谢以及细胞内基因与蛋白、蛋白与蛋白之问的相互作用。

随着对外源基因表达研究的不断深入，更多表达机理和影响因素的发现，相信在不久的将来，外源基因的表达将不断优化。