手性苯基乳酸的生产开题报告

全文总字数：5204字

1. 研究目的与意义

防腐剂是食品工业中最重要的添加剂之一，我国目前使用的主要是以苯甲酸钠、山梨酸钾等为代表的化学防腐剂。但是随着人们生活水平的提高和对食品安全的日益重视，消费者要求降低化学防腐剂的使用和追求安全性高的天然食品，这使得寻求天然、广谱、低毒的生物防腐剂成为食品工业中的重要发展方向。在天然防腐剂中，微生物防腐剂主要以天然农产品为原料，用发酵等生物技术制备，具有安全无毒、适用性广、性能稳定等优点，成为食品科学研究中的热点之一。

苯乳酸是一种新型的抑菌物质，具有较广的抑菌谱，可以抑制腐败菌、致病菌，特别是对真菌的感染。存在于天然蜂蜜中，现已发现与丹参素药理作用相同[1,2]，有望在未来成为一种新型的的防腐剂应用于食品工业及药物制剂。作为一种天然抑菌化合物，其抑菌特性已受到研究者的广泛关注[3]，特别是它能抑制真菌的污染可延长食品的货架期，为天然抑菌化合物在食品保鲜中的应用提供了诱人的前景。由于苯基乳酸α位的碳原子是手性碳原子，故有d-苯基乳酸和l-苯基乳酸两种对映体，这两种构型的化合物对生物体的作用及其在医药、化工方面的应用不同，但目前文献中所报道的苯基乳酸生产方法多为两种同分异构体的混合物。

本实验是将来自奇异变形杆菌的l-氨基酸脱氨酶（l-aad）克隆表达到实验室保藏的e.colibl21(petduet-ldhl-fdh)菌株中，构建成一株从l-苯丙氨酸通l-氨基酸脱氨酶催化合成苯丙酮酸，在通过l-乳酸脱氢酶催化合成苯基乳酸，其中偶联了一个辅酶nadh再生途径，即在甲酸脱氢酶催化下将甲酸变成co2,并提供nadh的反应。

2. 国内外研究现状分析

近年来主要有这几种方法[11]：(1)吖内酯(azlactone)锌汞齐还原法；(2)由β-苯基丙烯酸锌汞齐还原法；(3)用苯甲醛经缩合、开环、水解、还原4步反应制得，合成路线中用clemensen还原法将α-酮酸还原为α-羟基酸；(4)由苯丙酮酸（简称ppa）催化氢化合成，李光兴等用苯丙酮酸催化氢化的方法成功合成了β-苯基乳酸。该方法以甲醇为溶剂，在70℃，3.0mpa条件下，苯丙酮酸经raney-ni催化氢化反应lh后得到了β-苯基乳酸的白色针状结晶，收率91%，转化率91%。(5)周小鸣等用e-肉桂醇为原料经sharpless不对称环氧化合成了具有光学活性的β-苯基乳酸及其衍生物[11]。这些方法都在不同程度上存在技术复杂、污染环境、产品不纯、不能得到单一构型化合物等缺点，因而近几年来转向了生物合成法的开发与研究[12,13]。

生物催化是利用微生物有机体或酶实现化学转化的过程，与普通化学催化相比，生物催化体系具有以下优点：选择性高，尤其是位点选择性和立体选择性；收率高，可以实现100%的理论催化收率；反应条件温和，一般在常温常压下进行，耗能低；环境友好，有机体或酶的本质都是蛋白质，可被简单方便地回收利用。生物催化因其众多优点，逐渐成为生物技术中一个快速发展的领域。

早在1986年，kamata等就用乳糖发酵短杆菌(brevibacteriumlactofermentum)发酵生产了d-苯基乳酸，产量为1.94g/l，并且申请了专利。1996年，hashimoto等从土壤中筛选到了一株假单胞菌(pseudomonassp.)bc-18，能将苯乙醛-氰醇转化为l-苯基乳酸。这一转化有较高的对映选择性，生成的l-苯基乳酸的e.e.值为75％，再经过优先结晶，e.e.值可达到99％。该菌株经诱变后，l-苯基乳酸的产量是出发菌株的12倍。1998年，dieuleveux等从白地霉(geotrichumcandidum)的培养液中也分离到了d-苯基乳酸，该菌株在tsbye(trypticasesoybrothwithyeastextract)培养基中产生l-苯基乳酸的量为0.6g/l～1g/l。2000年，lavemicocca等发现从发酵面团中分离到的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)21b能分泌d-苯基乳酸，他们将植物乳杆菌接种在小麦粉水解液中，30℃培养24h，产生的d-苯基乳酸量为0.009mol/l。2002年，katrin等从青贮草中也分离到了一株l.plantarummilab393，它产生的l型和d型苯基乳酸的比例为9:l[14]。

3. 研究的基本内容与计划

实验内容计划：

（1）构建重组大肠杆菌：将来自奇异变形杆菌的l-氨基酸脱氨酶基因克隆到实验室保藏的e.colibl21(petduet-ldhl-fdh)中，筛选得到重组转化子。

（2）全细胞催化：将菌株进行全细胞催化，以l-苯丙氨酸，甲酸钠为底物合成苯基乳酸的产量。

4. 研究创新点

苯基乳酸是一种由乳酸菌产生的防腐剂，由于它来源于天然益生菌，安全性能高，而且抑菌谱非常广泛，对细菌、霉菌都具有显著的抑制作用，所以在食品保鲜、烘焙等行业有广阔的应用前途。另外，苯基乳酸也是多种药物的前体。采用简便快速的方法合成苯基乳酸具有非常重要的意义。由于苯基乳酸α位的碳原子是手性碳原子，故有D-苯基乳酸和L-苯基乳酸两种对映体，这两种构型的化合物对生物体的作用及其在医药、化工方面的应用不同，但目前文献中所报道的苯基乳酸生产方法多为两种同分异构体的混合物。

本实验是将来自奇异变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶（L-AAD）克隆表达到实验室保藏的E.coliBL21(pETDuet-ldhL-fdh)菌株中，构建成一株从L-苯丙氨酸通L-氨基酸脱氨酶催化合成苯丙酮酸，在通过L-乳酸脱氢酶催化合成苯基乳酸，其中偶联了一个辅酶NADH再生途径，即在甲酸脱氢酶催化下将甲酸变成CO2,并提供还原NADH的反应。