木质纤维素同步糖化发酵制备L-乳酸的研究开题报告

 2021-08-31 11:08

1. 研究目的与意义

目前,乳酸发酵主要是以糖料、淀粉等粮食作物为原料,不仅消耗粮食资源,而且使乳酸成本居高不下,从而限制了乳酸的应用,尤其是限制了聚乳酸在环保领域的应用。

课题主要研究内容为木质纤维素同步糖化发酵制备L-乳酸的研究,为实现木质纤维素高效利用生产乳酸提供依据。

2. 国内外研究现状分析

3 国内外研究现状

3.1 L-乳酸发酵菌种

自然界中可产生乳酸的微生物很多,因为分解糖类产生乳酸对于生物来说,是一种获得能量的最原始手段之一。但产乳酸能力强,可以应用到工业上的只有霉菌中的根霉属和细菌中的乳酸菌类。根霉属中常用的菌种有米根霉、行走根霉、小麦曲根霉和美丽根霉。乳酸生产对于菌种的要求是,产酸迅速,副产物少,营养要求简单,耐高温。这样可以避免杂菌污染,加速发酵进程,提高产率,便于后续提取工艺操作。德氏乳杆菌:能利用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、糊精等碳源,发酵产生D-乳酸,少数产生DL-乳酸。在不加中和剂的情况下,最高生成乳酸浓度可达16g/L。最适生长温度为45℃,在50℃仍能旺盛发育并产酸,最高耐受温度为55℃。赖氏乳杆菌:能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和海藻糖产酸。利用半乳糖、甘露醇和α-甲基配糖物生成微量酸。植物乳杆菌:多数菌株能利用葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖产酸,较小程度上利用山梨醇、甘露醇、糊精、甘油、木糖产酸。通常不发酵鼠李糖、淀粉和菊芋糖。米根霉:最适合发育温度为37℃,41℃亦能生长,有淀粉糖化能力。发酵生产乳酸最适温度为30℃,可利用无机氮源,如尿素、硝酸铵、硫酸铵等。

菌种类型

L-乳酸的产量

参考文献

德氏乳杆菌

16g/L

[21]

植物乳酸杆菌

12g/L

[21]

米根霉

113g/L

[22]

3.2 L-乳酸生产工艺

利用木质纤维素生产L-乳酸的方法主要有3种:直接发酵法、分别糖化发酵法和同时糖化发酵法。也有一些文献报道了用固定化细胞发酵法和细胞循环发酵法等生产L-乳酸的新工艺。

直接发酵法 直接发酵法就是以木质纤维素类物质为原料进行直接发酵,不经过酸解或酶解的前处理。这种工艺所需设备简单。生产成本少,但乳酸产量低,并易产生副产物。近年来混合菌发酵的研究,为直接发酵法提

供了新的发展方向。

分别糖化发酵法(SHF) 分别糖化发酵就是先用纤维素酶水解底物中的纤维素类产物.等其水解后再进行发酵。这种工艺的主要优点是可以分别控制酶解和发酵的最优工艺条件,使水解比较完全。其缺点是:①水解时产物抑制和发酵时高基质浓度抑制;②容易污染杂菌;③生产周期长。

同步糖化发酵法(SSF法) 同步糖化发酵法就是将纤维素原料的酶解与乳酸发酵同时进行,酶解为发酵提供碳源,发酵可消耗纤维素分解的五碳糖和六碳糖,消除产物反馈抑制,从而提高整个生产过程的效率。同时糖化发酵法是生产L-乳酸简化工序的最有效途径,不仅可以简化没备工艺,减少设备投资,缩短生产周期,节约能源,而且能提高菌种的利用率,有利于实现L-乳酸的工业化生产,本论文就是采用了这种方法制备L-乳酸。

3.3 生物质L-乳酸研究现状

徐忠等人[8]在实验条件下,50g.L-1的大豆秸秆经酶水解后,还原糖浓度为242.25mg.g-1,纤维素糖转化率为51.22%。对酶解液利用清酒乳杆菌及干酪乳杆菌进行L-乳酸发酵工艺过程进行研究,结果表明酶解液中葡萄糖可为乳杆菌完全利用,实验条件下,两种乳杆菌单菌种及混合菌种L-乳酸发酵,葡萄糖对L-乳酸转化率分别为48.27%、56.42%和71.05%。乔长晟等人[9]研究,利用米根霉对玉米芯采用同时糖化发酵的工艺,在温度34℃下,糖化发酵72 h后,L-乳酸的产量为24.80 g /L,还原糖残留量为4.55 g /L,纤维素的转化率达到了58.7%。丁绍峰等[10]采用豆粕水解液为氮源代替酵母粉,同时应用流加发酵技术,L-乳酸产量、得率、产率及转化率分别达到155 g /L,95.5 g /g,1.64 g /(L.h)和96.9%。高年发等[11]将玉米粉经双酶法得到的玉米糖化液作为L-乳酸发酵的主要碳源,以小肽-3为唯一氮源,利用响应面分析法得出初糖浓度:小肽-3为15.5:1摇床培养(通风)时间为24.27h时,乳酸产量最高为143.8g/L,转化率为95.8%。李剑等[12]筛选到一株产D,L-乳酸的乳杆菌MD-1,能在48℃含200g/L葡萄糖的发酵液中快速生长并生产乳酸,72h乳酸产量可达140g/L以上;并且初步分析了乳酸脱氢酶的序列及编码蛋白质的一级结构,对其功能进行了鉴定。李海军等[13]将鼠李糖乳杆菌经耐高糖高酸选育后,以酵母粉为氮源和生长因子,葡萄糖初始浓度分别为120g/L和146g/L,摇瓶培养120h,L-乳酸产量分别为104g/L和117.5g/L,L-乳酸得率分别为86.7%和80.5%。徐子钧[14]以代谢调控发酵理论为依据,利用紫外线、亚硝基胍、DES等理化因子对从自然界筛选到的乳酸菌进行复合诱变,再用高浓乳酸钙平板、纯乳酸平板、琥珀酸平板筛选得到一株高产L-乳酸的正向突变株M7,平均发酵产量90g/L,比原菌株产量提高30%,对糖的转化率为88.9%。采用基因组改组技术对鼠李糖乳杆菌进行提高耐酸性和L-乳酸生产速率的研究,可获得一株能够在pH3.6 条件下生长的突变株Lc-F34,在pH3.8 条件下,L-乳酸产量提高了3.1 倍;在CaCO3 中和pH 值条件下,L-乳酸的生产速率达到5.77g/Lh,比原始菌株提高了(26.5 1.5)%。 [15]

Miura[16]等用纤维素酶产生菌与乳酸产生菌混合培养, 直接转化玉米芯生产乳酸, 100g /L粗玉米芯生产L-乳酸24g /L。Beatriz Gullon 等人[17] (2006年),以苹果渣(来源于苹果酒和苹果汁厂)为原料,用Lactobaeillus rhamnosus CECT-288发酵酶解后的苹果渣6h后,得到L-乳酸的产量为32.5 g /L,处理后原料的转化率达到了88%。Zhou[18]等将乳酸片球菌中的L-乳酸脱氢酶的编码片段和终止子转入大肠杆菌中ldhA基因的启动子的下游,替代了其原有的D-乳酸脱氢酶基因,成功构建了产L-乳酸的SZ79等多株菌株,并通过进一步的选育,最终培育出了一株L-乳酸的高产菌株SZ85。该菌株在只含葡萄糖及无机盐的培养基中对糖的总转化率达到94%,产物中L-乳酸的含量达到99%。Gao等[19]对鼠李糖乳杆菌NBRC3863产酸进行优化,采用廉价的米糠水解液(30g/L,初始pH=l)加少量的酵母提取物(3g/L)取代单独使用酵母提取物(15g/L),乳酸产率提高了1.6倍。在初始葡萄糖浓度为110g/L时,乳酸最终浓度可达到103 g/L。EDDNG-TONJM等[20]采用亚硝基胍(NTG)等作诱变剂,经6轮诱变处理,得到产生接近100%纯L2乳酸的变异株NRRL B230574菌株及NRRL B-30575菌株。诱变育种方法菌种突变的频率比自发突变有大幅度提高,筛选周期也大幅度缩短。其缺点是诱变剂所诱发的遗传性状的改变是随机的,筛选正向突变的工作量大。

3.4 存在的问题及解决方法

综述目前研究状况,利用木质纤维素原料(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖)生产乳酸存在的问题及解决方案:一是纤维原料中的戊糖和己糖不能同时被利用。原料利用率不高。自然界中的乳酸菌都能发酵葡萄糖以及其他的己糖,但只有少数乳酸菌能利用戊糖,发酵戊糖的乳酸菌有乳酸乳球菌、乳酸杆菌、乳杆菌和布氏乳杆菌等。纤维原料中戊糖占很大一部分比例,含量大约为10%一15%,如果能把这部分原料利用起来,那么植物纤维的利用率就会大大提高,因此通过基因工程选育能同时发酵己糖和戊糖的优良菌株就显得格外重要。二是纤维素酶解效率不高.水解产物对酶有抑制作用。水解产物中的纤维二糖是纤维素酶的主要抑制物。葡萄糖也有轻微的抑制作用。目前已有几种方法减少这些抑制作用,包括提高酶的浓度、水解过程中添加纤维二糖酶或者通过SSF法消耗糖,很大程度上减少了产物对酶的抑制作用,是目前比较通用且有效的方法。三是SSF法中糖化和发酵工艺参数不一致。糖化酶一般在4650℃下达到最佳的酶解效果,而菌体代谢一般在37~43℃有稳定的代谢产物.要想使2种工艺都达到最佳效果就必须提高菌体的耐热性。培养耐热突变菌株是目前解决这一问题较好的的方法。四是发酵产物的提纯与分离。随着发酵的进行。发酵液中酸浓度越来越高,为了维持菌体正常生长的pH值,传统方法是向发酵液中加入碳酸钙,但这会增加后期的分离成本,实际生产过程中乳酸的分离成本占整个成本的2/3。因此必须改进和设计新型发酵设备,以适应高浓度发酵、连续发酵与原位分离相结合的先进发酵工艺。

尽管纤维原料生物转化乳酸已成为国内外的研究热点。并取得多方面进展,但离工业化生产还有一定距离。其根本原因在于原料利用率低、纤维素酶用量大、产物浓度低以及产品不易分离,导致生产成本过高,因此提高酶活、选育优良菌株和开发新型发酵工艺减低生产成本是当前阶段的主要目标。目前一些新的研究成果,如原料新型预处理技术、固定化酶及固定化细胞技术、高产菌株的选育以及新型生物反应器的不断发展,利用木质纤维原料制L-乳酸有很好的发展前景。但是纤维原料制L-乳酸是由多个环节组成的较复杂的工艺流程,而各种技术的创新却是零散的,要加快其产业流程。结合环境保护,节约粮食及石油资源,应进一步加强由工业、农业生活中有机废弃物资源化技术制备L-乳酸的研究、尤其是可再生资源的利用,就必须对各种技术加以集成与优化,并将优化工艺放大到一定规模上评价其经济可行性,如此得出的结论更切合实际生产。

3. 研究的基本内容与计划

课题主要研究内容为木质纤维素同步糖化发酵制备l-乳酸的研究,为实现木质纤维素高效利用生产乳酸提供依据。

2.21-3.05 查阅相关资料,写好开题报告。

3.05-3.15 建立实验必须的分析方法。

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4. 研究创新点

凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)是被美国、欧盟、日本批准做为饲料添加剂使用的微生物。它是同型乳酸发酵的芽抱杆菌,除具有一般乳酸菌的维持肠道微生态平衡,刺激免疫,提高动物消化功能等益生作用外,还具有对不良环境的抵抗力,特别是抗胃酸,抗热和抗干燥的能力。在微生物发酵L-乳酸的菌种方面目前国内主要还是采用根霉发酵生产L - 乳酸,由于是好氧菌,及常温发酵需要较高的空气及搅拌系统,对电、蒸汽等能源的消耗较大。而且由于根霉发酵属于异型乳酸发酵,在发酵乳酸的同时还进行其他途径的代谢,有大量杂酸伴生使葡萄糖转化率低。而用细菌特别是凝结芽孢杆菌发酵,其转化率可达90%以上且L-乳酸纯度较高。而且凝结芽孢杆菌发酵生产L-乳酸是在厌氧、高温下进行,减少了发酵罐的搅拌能耗及冷凝水用量从而节约生产成本。

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