石花菜多糖的提取纯化、理化性质及其生物活性开题报告

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

实验方案：

一、多糖的提取纯化：所购鲜石花菜经过挑拣出去杂质，清洗掉盐粒，将其剪成小段，以便于后续处理。将石花菜放于烘箱中，60℃烘干，经粉碎机粉碎，保存于干燥器中备用。

取上述石花菜粉进行提取，按料液比1:30、温度60℃、提取次数3次，提取时间30 min，以盐酸0.1 M浸提，结束后合并滤液，先用纱布过滤去除残渣，再进行抽滤。将滤液缩小至一定体积后加入3-4倍体积无水乙醇过夜醇沉，离心取沉淀物加入超纯水复溶，待沉淀溶解，离心取上清液，浓缩至一定体积分装至培养皿中-20℃预冻，经冻干后得石花菜粗多糖。

二、清除DPPH自由基：吸取不同浓度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）的石花菜多糖溶液50μL于96孔板中，加入0.4mmol/L 的DPPH无水乙醇溶液25 μL，再依次加入100 μL超纯水后晃匀，于暗处30℃反应0.5 h，反应结束后于517nm处测定吸光值。1、同样浓度梯度的Vc作为阳性对照，同样进行吸光值测定。2、用无水乙醇代替DPPH溶液为另一对照，同样进行吸光值测定。

三、清除超氧阴离子自由基：吸取不同浓度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）的石花菜多糖溶液50μL于96孔板中，加入156μmol/L 的NBT溶液50 μL、468 μmol/L 的NADH溶液50 μL、60 μmol/L 的PMS溶液50 μL后晃匀，于25℃反应5 min，反应结束后于560nm处测定吸光值。1、同样浓度梯度的Vc作为阳性对照，同样进行吸光值测定。2、用PBS代替NBT溶液为另一组对照，同样进行吸光值测定。

四、清除ABTS自由基：ABTS工作液配制：7 mmol/LABTS溶液与4.95 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，与暗处、室温放置12 h待用。

反应开始前将ABTS工作液以PBS溶液（0.2 M ,pH=7.4）稀释至一定浓度，使其吸光值处于0.70±0.02左右。吸取不同浓度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）的石花菜多糖溶液20μL于96孔板中，加入200μL ABTS工作液混匀，于室温反应6 min，反应结束后于734nm处测定吸光值。1、同样浓度梯度的Vc作为阳性对照，同样进行吸光值测定。2、用PBS代替ABTS溶液为另一组对照，同样进行吸光值测定。

五、还原能力测定：吸取不同浓度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）的石花菜多糖溶液50μL于96孔板中，加入0.2mol/L PBS溶液（pH=6.6）50 μL，再依次加入1%铁氰化钾溶液50 μL晃匀，于暗处50℃反应20 min，反应结束后冷却至

室温，加入10%三氯乙酸50 μL和0.1%氯化铁溶液25 μL，,700 nm处测定吸光值。

1、同样浓度梯度的Vc作为阳性对照，同样进行吸光值测定。2、用水代替氯化铁为另一组对照，同样进行吸光值测定。

可行性分析：

1、理论可行

石花菜多糖具有一定抗氧化能力，对超氧阴离子自由基和羟基自由基均具有清除作用，在一定范围内，浓度越高清除能力越强石花菜多糖还可以促进抑制炎性酶的表达并且抑制促炎因子释放，具有一定抗炎作用。除此之外，石花菜多糖还具有抑菌、降脂、抗凝血等作用。本课题研究石花菜多糖的抗氧化能力即对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和ABTS自由基的清除能力。我认为本项目基于正确的理论，可行。

2、实验方法与技术可行

本项目采取的实验技术和实验方法主要有比色法、DPPH法、超氧阴离子法、ABTS法等，大部分实验技术和方法已在研究工作中得到应用，本课题指导教师在糖类的研究领域拥有丰富的经验，因此本项目的实验方法与技术以及理论指导是可行与可靠的。

技术路线：