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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.课题的意义
发酵乳为以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的ph值降低的产品[1]，该类产品的特征菌大量存在并且能够存活且具有活性。发酵乳在人和动物肠道内，通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡进而促进有益成分代谢，起到降血脂、提高免疫力、防治消化道和代谢性疾病等作用，其具有的独特风味和营养保健功能，使之成为一种受到大众青睐的食品。为了改善发酵乳的口感，往往在发酵前会加入某些添加剂如增稠剂、益生元等，益生元是通过肠道内微生物的代谢作用和可选择性地刺激肠道内微生物的增殖或活力，进而对宿主的健康产生有益影响的非消化性成分[2, 3]；食品增稠剂是一种具有改善食品品质、增强食品粘稠度、提高凝胶特性的食品添加剂，溶于水中可形成黏稠、润滑的大分子颗粒，又称食品胶[4]，由于发酵乳在发酵、贮藏、运输过程中会不同程度出现黏度变低、组织形态粗糙、乳清析出等品质问题，所以添加入不同种类的增稠剂可以改变发酵乳组织状态，减弱不良问题出现的程度。本课题采用实验室分离的保加利亚乳杆菌制作发酵乳，添加不同的益生元与增稠剂，作比较实验。目前消费者很关注发酵乳中各种食品添加剂如增稠剂等是否对人体健康产生影响，所以本课题设计的研究内容具有重要意义。
2.国内外研究进展
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
采用实验室发酵牛乳的方法，在牛乳发酵前加入益生元与增稠剂，通过模拟人体体外消化消化，进行可溶性蛋白含量检测、sds - page电泳、小肽含量检测以及氨基酸含量检测，将添加食品添加剂与未添加的发酵乳进行对比，研究增稠剂及益生元的添加对人体消化发酵乳后蛋白质降解情况的影响。
2.研究内容
3. 研究的方法与方案
1.研究方法及实验方案
（1）发酵乳的发酵
1.1第一次活化
于超净工作台中向灭完菌的50 mL三角瓶倒入30 mL纯牛奶，接入实验室分离的保加利亚乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus），置于培养箱中37℃恒温培养12 h。
1.2第二次活化
于超净工作台中向灭完菌的50 mL三角瓶倒入30 mL纯牛奶，接入第一次活化所得菌种，接种量为5%(V/V)，置于培养箱中37℃恒温培养4 h。
1.3发酵
取0.06 g益生元（增稠剂）及0.3 g绵白糖，混匀后加入10 mL纯水浸泡2-3 h至益生元（增稠剂）完全溶解。称取3.9 g奶粉，加入20 mL纯水溶解后将溶解的益生元（增稠剂）与之混合，置于水浴锅中90℃水浴10 min灭菌。于超净工作台中接入第二次活化所得菌种，接种量为5%(V/V)，置于培养箱中37℃恒温培养4 h。
（2）模拟人体体外消化
2.1 消化液的配制
表1 胃消化液的配方
| 胃 | SSF(mmol-1) | 分子量(g/mol) | m/100ml(g) |
| KCl | 6.9 | 74.55 | 0.05144 |
| KH2PO4 | 0.9 | 136.09 | 0.012248 |
| NaHCO3 | 25 | 84.01 | 0.210025 |
| NaCl | 47.2 | 58.44 | 0.275837 |
| MgCl2(H2O)6 | 0.1 | 203.3 | 0.002033 |
| (NH4)2CO3 | 0.5 | 157.12 | 0.007856 |
| HCl | 调pH 1.6 | 36.46 |
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表2 肠消化液的配方
| 肠 | SSF(mmol-1) | 分子量(g/mol) | m/100ml(g) |
| KCL | 6.8 | 74.55 | 0.050694 |
| KH2PO4 | 0.8 | 136.09 | 0.010887 |
| NaHCO3 | 85 | 84.01 | 0.714085 |
| NaCl | 38.4 | 58.44 | 0.22441 |
| MgCl2(H2O)6 | 0.33 | 203.3 | 0.006709 |
| (NH4)2CO3 | 0 | 157.12 | 0 |
| HCl | 调pH 7.0 | 36.46 |
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注：胃蛋白酶：250 u/mL，胃粘液素：1.5 g/L，胰液素：200 u/mL，胆盐：8.17 g/L
拟胃消化
称取6.25 mg胃蛋白酶与15 mg胃粘液素，分别溶于10 mL胃消化液中，于38℃水浴锅中水浴活化20 min，即为模拟胃液。用注射器吸取15 mL上述两种酶液的混合液用于胃消化，仿真小鼠胃中加入600 μL模拟胃液与5 mL发酵乳样品，安装好模拟人体体外消化仪器，仪器运行参数为：胃液注射泵速度为52 μL/min，排空注射泵速度为70 μL/min，胃倾斜角度为8°，胃挤压速度为3 rpm/min，胃滚轮速度为12 rpm/min，消化时间为2 h，每30 min取一次样，取样后样品用2 mol/L的NaOH调pH至中性，置于-20℃冰箱中保藏。
2.3 模拟肠消化
取6.25mg胃蛋白酶与15mg胃粘液素，分别溶于10mL胃消化液中，取56.2mg胰液素与81.7 mg胆汁盐，分别溶于10 mL肠消化液中，于水浴锅中38℃水浴活化20 min，即为模拟肠液。用胃液注射器吸取15 mL模拟胃液，肠液注射器吸取15 mL模拟肠液。向仿真小鼠胃中加入600 μL胃液混合液与5 mL发酵乳样品，安装好模拟人体体外消化仪器，仪器的运行参数为：胃液注射泵速度为52 μL/min，肠液注射泵速度为52 μL/min，排空注射泵速度为100 μL/min，胃倾斜角度为8°，胃挤压的速度为3rpm/min，胃滚轮速度为12rpm/min，肠滚轮速度为12rpm/min，消化时间为2 h，每30 min取一次样，取样后样品用2 mol/L的NaOH调pH至中性，放于-20℃冰箱中保藏。
（1）考马斯亮蓝法测可溶性蛋白含量
3.1 试剂的配制
①牛血清白蛋白标准液(100ug/mL）：精确称取0.0100g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。
②考马斯亮蓝G-250染色液：称取0.10g考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100mL85%（W/V）磷酸，将溶液用蒸馏水定容至1000mL，过滤待用。
3.2 考马斯亮蓝G-250比色法测蛋白质含量
①标准曲线制作
取6个2mL离心管，编号
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 蛋白质标准液（mL） | 0 | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 |
| 蒸馏水（mL） | 0.2 | 0.16 | 0.12 | 0.08 | 0.04 | 0 |
| 考马斯亮蓝G-250试剂（mL） | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
将溶液混匀，在595 nm测其吸光值，以1号为空白对照。以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
②蛋白质浓度测定：胃消化样品稀释50倍，肠消化样品稀释10倍，取200uL加入1mL考马斯亮蓝，将溶液混匀，在595nm测其吸光值。利用标准曲线计算样品可溶性蛋白含量。
（1）SDS-PAGE测蛋白质分子量
4.1 主要试剂的配制
30% Acr/Bis：称取29.2 g Acr和0.8 g Bis，用蒸馏水定容至 100 mL ，过滤备用。
10% APS：准确称取0.1 g过硫酸铵，用1 mL蒸馏水充分溶解。（现配现用，可在4℃保存一周）
2x上样缓冲液：准确量取2 ml 0.5 mol/L的Tris、2 ml甘油、2 mL 10% (W/V)SDS、0.5 mL的0.1%溴酚蓝、1 mL的巯基乙醇、2.5 mL的蒸馏水，充分混合。
5x电泳缓冲液：称取7.5 g Tris、2.5 g SDS、36g Gly，用蒸馏水充分溶解并定容至500 ml，使用时稀释5倍。
染色液：准确称取0.2 g考马斯亮蓝R250固体、量取84 mL95%乙醇、20 mL冰醋酸，用蒸馏水定容至200 mL，过滤备用。
脱色液：准确量取90 mL95%乙醇，10 mL冰醋酸，用蒸馏水定容至200 mL。
4.2 电泳样品的处理
取200μL消化后样品稀释一倍后，取200μL稀释后的样品加入200 μL上样缓冲液，混匀后沸水浴5 min，13500 rpm/min离心10 min，取上清即为电泳样品。
4.3 制胶
①分离胶的配制（15%）
表3 15%分离胶配方
| 加入试剂 | 剂量 |
| 双蒸水/mL | 4.7 |
| 1.5 M Tris-HCl(pH 6.8)/mL | 5 |
| 10%(W/V)SDS/μL | 200 |
| 30%(W/V)Acr/Bis/mL | 10 |
| 10%(W/V)APS/μL | 100 |
| TEMED/μL | 10 |
| 总体积/mL | 20 |
混匀后倒入玻璃板夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水，等胶自然凝固后倾倒出蒸馏水。
②浓缩胶的配制（4%）
表4 4%浓缩胶配方
| 加入试剂 | 剂量 |
| 双蒸水/mL | 6.1 |
| 0.5 M Tris-HCl(pH6.8)/mL | 2.5 |
| 10%(w/v)SDS/μL | 100 |
| 30%(w/v)Acr/Bis/mL | 1.3 |
| 10%(w/v)APS/μL | 50 |
| TEMED/μL | 10 |
| 总体积/mL | 10 |
混匀后加入玻璃板夹缝中，并插入梳子，待胶凝固后小心拔出梳子。
4.4 电泳流程
①准备：将制备好的凝胶置于电泳槽，加入稀释五倍的电泳缓冲液。
②上样：用移液器按照既定顺序点样（胃消化样品为10 μL，肠消化样品为20μL，蛋白标品为1μL）。
③接通电源，保持电压60 V约40 min，待溴酚蓝指示剂前沿到达分离胶与浓缩胶的分界面，并形成一条直线时，调节电压至120 V，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部约0.5 cm处时，关闭电源。
④染色：取出胶板，从玻璃板上取下凝胶，用染色液浸泡凝胶置于摇床上大约2 h。
⑤脱色：将凝胶转移至脱色液中过夜，第二天观察并拍照。
（1）OPA法测小肽含量
5.1 主要试剂配制
①OPA配方：
200mL OPA：100mL100mM/L硼砂（四硼酸钠）
10mL20%(W/V)SDS
4mL40mg/ml邻苯二甲醛（OPA）
400uLβ-巯基乙醇
100mM/L硼砂：称取3.8137g硼砂，加入纯水溶解定容至100 mL
20%(W/V)SDS：称取4g SDS溶于20 mL娃哈哈
40 mg/ml邻苯二甲醛（OPA）：称取200 mg OPA溶于5 mL甲醇
②4%(W/V)TCA：称取4 g TCA溶于100mL纯水中
③胰蛋白胨标准液：称取50mg胰蛋白胨融入5 mL水中（10mg/mL），分别稀释至2 mg/mL，4 mg/mL，6 mg/mL，8 mg/mL。
样品处理
取200μL消化后样品，加入等量TCA后置于4℃冰箱中静置2-3h，13500rpm/min离心10min，取上清。
5.3 OPA法测小肽含量
①标准曲线的制作
取各浓度的胰蛋白胨标准液50 μL，加入2mL OPA，反应2min后测其在340 nm处的吸光值，以吸光值为纵坐标，胰蛋白胨浓度为横坐标，绘制标准曲线。
②OPA法测小肽含量
取处理好的样品50μL，加入2 mL OPA，反应两分钟后用紫外分光光度计测其在波长340 nm处的吸光值，利用标准曲线计算其小肽含量。
（1）氨基酸含量检测
采用总氨基酸测定试剂盒，样品处理同测量小肽含量，按试剂盒步骤添加样本及反应液后旋涡混匀，加入显色剂显色，3500rpm/min离心10min，取上清，利用酶标仪测其在650 nm处的吸光值，用氨基酸含量标准曲线计算其氨基酸含量。
2. 技术路线
3.可行性分析
此前，已有研究者通过静态消化，研究了黄原胶、果胶、明胶对发酵牛乳消化特性的影响，得出了以下结论：添加增稠剂的酸奶样品，在消化的过程中，可溶性蛋白的产生量和水解度两个指标均受到影响。添加明胶的酸奶在模拟体外消化之后，几乎所有的大分子蛋白均被水解，消化几乎不受影响，甚至和对照组比，更有促进消化的作用，而添加果胶和黄原胶的酸奶在模拟体外消化之后，仍残留部分大分子蛋白，消化受到了抑制。此外，也有学者利用动态模拟消化系统进行了食品营养消化吸收当面的研究。
由此可见，采用动态消化探究益生元及增稠剂对发酵牛乳的消化特性的影响具有较高的可行性和合理性。
4. 研究创新点
1.本课题选用了动态模拟消化来研究增稠剂对发酵牛乳消化特性的影响，不同于以往的静态模拟人体消化系统，其更能接近于人体消化情况，
2.选择的食品添加剂涵盖了市面上绝大部分发酵乳会添加的益生元及增稠剂。
5. 研究计划与进展
2018年9月-2018年10月：完成课题的确认、查阅相关文献设计实验。同时，进入实验室进行相关实验操作的训练。进行一部分的预实验。
2018年11月-2019年1月：完成文献综述的撰写；完成四种益生元的添加对发酵牛乳消化特性影响的研究。
2019年2月-2019年4月：完成开题报告和中期检查；完成八种增稠剂的添加对发酵牛乳消化特性影响的研究。
