1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、研究意义卤化物是次级代谢产物中重要的一类，并且在医药、工业和农业领域中被广泛应用[1]。
若想显著增加卤化物的生物活性，通常会引入卤素。
卤化酶是许多微生物卤化物合成途径中关键的修饰酶[2]，但利用传统的化学合成手段又很难获得有活性的卤化酶,因此利用珠峰文库,能克服99%的微生物不能在实验室进行培养的缺点[3]，对微生物整体产生生物活性天然产物的潜力进行研究，将有助于发掘新的卤化酶和次生代谢卤化物，了解其合成机制和表达机理，为进一步深入了解卤化酶的修饰作用和催化机制积累经验，并为新型卤化酶基因的筛选和表达的研究奠定基础。
2. 研究的基本内容和问题
1、研究目标1.发现2-3个新的生物合成相关酶基因序列；2.表达出对应卤化酶蛋白。
2、研究内容2.1 基于序列分析的单克隆筛选利用简并引物筛选珠峰文库质粒，将少量样品通过pcr扩增，利用水平电泳槽进行电泳检测，将目的条带切胶回收；胶回收产物进行二次pcr（聚集产物），通过测序与ncbi比对，最后用特异引物与96孔板筛选得到我们所需的单克隆。
2.2 寻找完整的orf将上述所得的单克隆进行orf测序，进而寻找完整的orf。
3. 研究的方法与方案
1、研究方法及实验方案1.1 宏基因组文库的构建将采集的珠峰土壤样品先后通过不同孔径的筛网筛理，除去昆虫与树根，采用直接裂解法裂解土壤样品中的菌体，提取出土样中的dna，用电泳方法确定总dna在凝胶上的位置，纯化、回收构建宏基因组文库所需的30-45 kb的基因片段，经末端补平酶末端补平后，根据pweb-tnc cosmid cloning kit的方案进行文库构建。
1.2 筛选阳性克隆及其亚克隆菌株制备采用序列筛选的方法筛选卤化酶，选用hornung a等人从已知天然产物的卤化酶氨基酸保守序列出发设计的简并引物，筛选出卤化酶相关的基因，将筛选的阳性克隆平板培养，挑取单菌落养菌并提质粒，用限制性内切酶对小提的质粒进行部分酶切，将酶切产物进行电泳检测，采用胶回收试剂盒对集中在marker2kb-4kb对应位置的胶块进行切胶回收。
回收产物连接至载体中，电转化epi100/bl21；1.3 生化反应/hplc检测电转化后进行诱导表达，看其生化反应/hplc检测，寻找合适的诱导表达条件。
4. 研究创新点
卤化酶来源丰富，但应用广泛。
目前仍然缺乏对卤化酶的研究，因此进一步探索在生物体和生物环境中寻找新型卤化酶无疑将具有巨大的潜力。
而本项目利用宏基因组学的方法研究土壤中不可培养微生物，进一步挖掘其中的微生物卤化酶基因资源，筛选得到含新型卤化酶基因的阳性克隆，为未来发掘新型卤化酶机制提供了理论及技术支持。
5. 研究计划与进展
1.1 项目进展及计划课题拟从2017年10月开始到2018年5月完成。
2017.10 卤化酶基因同源序列筛选2017.11 构建亚克隆 获得阳性亚克隆2017.03 寻找完整orf，选择表达载体，设计表达引物，诱导表达，生化反应/hplc检测 2017.04-05 整理分析数据，完成结题报告，并撰写毕业论文。
2.2 预期研究成果1.从宏基因组文库中筛选获得新型卤化酶基因，并能在载体中正常表达； 2.在课题实行过程中培养独立科研思考能力，及比较熟练的实验技能；3.完成毕业论文。
