1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
crispr是生命进化历史上，细菌针对病毒所产生的一种特有免疫，利用这个系统，细菌可以把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。而基因敲除是自80年代末发展起来的一种分子生物学技术，它能够通过一定的途径使机体内特定的基因发生突变或缺失，从而达到改造机体，改变机体功能的目的。而本文所涉及的基因无痕敲除技术，即是借以基于这种细菌所具备的crispr/cas9免疫机制来改造目标菌的靶基因，从而改变目标菌的代谢途径。在后基因组的时代，随着基因测序手段的建立和功能基因的定位，对大肠杆菌的基因组结构与代谢规律已经有了深入的了解与认识。所以就大肠杆菌为主体，通过对其代谢的表观现象来验证基于crispr系统的基因无痕敲除技术的可行性。继而可以进行对基因的改造，以使目标生命体达到其最佳的生物学效应。而相比于其他基因编辑手段，它使用起来廉价、迅速且简单，并因此席卷全球实验室。研究人员希望利用它调整人类基因以消除疾病，创造生命力更加顽强的植物，并且消灭病原体。
由于crispr/cas技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成rna导向的dna识别及编辑，为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台，受到众多科学家的追捧。crispr-cas技术是继锌指核酸酶（zfn）、es 细胞打靶和 talen 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。
随着基因对crispr/cas9系统原理逐渐的理解与把握，科学家已经通过运用这项技术在动物如：斑马鱼、小鼠、大鼠、果蝇、线虫、食蟹猴、猪等以及植物如：水稻、拟南芥、高粱、烟草等的研究上有了重大的发展和突破，还包括基因治疗、家畜育种和人体细胞中顺式作用元件的功能性注释等等各个方面的研究，展现出广阔的发展前景。其中已经研究得到的编辑的类型有定点插入、小片段的缺失、多个位点同时突变等。但是crispr/cas9系统还是存在一些问题，其中以脱靶效应最为突出，高脱靶率会导致基因突变，基因丢失等不利于研究进展方向的事件发生，甚至会导致机体的死亡。所以克服脱靶效应带来的问题，也是当前crispr/cas9系统的一个核心问题。
2. 研究的基本内容和问题
本实验的研究的目标是利用携带外源基因的质粒通过crispr/cas系统对大肠杆菌进行基因无痕敲除，然后对其基因敲除的效率进行计算，验证基于crispr系统的基因无痕敲除的效率。
本实验研究的内容是：首先利用基因工程的手法制备导入携带外源基因质粒的工程菌，在crispr系统和重组系统下得到改造后的工程菌后，进行基因测序，计算基因敲除的效率，同时将改造后的工程菌分别在和质粒带有相同抗生素的培养基上进行培养，如工程菌无法存活，则表明工程菌的基因是无痕敲除的。
拟解决的关键问题有：
3. 研究的方法与方案
本实验研究方法是利用crispr/cas偶联重组的系统，加以一个二元复合载体ptargetf/pcas系统就能够完成基因敲除的工作。通过将pcas质粒导入到大肠杆菌中，同时电转入同源臂模板片段和ptarget质粒，即可达到敲除基因的目的。pcas在阿拉伯糖的诱导下产生重组酶，有利于同源重组的发生。ptarget会组成型的产生定位在目的基因的sgrna，与pcas产生的cas蛋白结合，sgrna中的20bp序列与目的基因碱基配对成功后，cas蛋白就会切断目的基因的双链。如果这个20bp定位在基因组上，那么基因组就会被切断且无法繁殖。但是如果同时导入线性的同源臂，在切口两侧发生同源重组，那么同源臂就会取代原来的基因序列，而使得繁殖继续下去。理论上，导入ptarget后未发生同源重组的基因片段将会因为基因组的被切断而无法繁殖，只有同源重组的菌体才能繁殖形成单菌落。pcas在iptg诱导下可以产生定位在ptarget上的sgrna，从而消化ptarget质粒，其本身也会在42摄氏度下被消除，因此可以逐步把敲除基因的菌株中两个质粒消除掉。
本实验的实验方案：
1对被敲除序列进行基因测序。通过其互补序列来进行sgrna序列的合成，将其克隆至ptarget的克隆位点中，同时保证限制性核酸内切酶的内切位点与该载体抗生素抗性基因的物理图谱相距一定距离，以防止抗生素对目标菌的影响。随后进行基于抗生素抗性的选择培养，筛选阳性克隆载体，如有条件，对该质粒进行测序，确保克隆成功。
4. 研究创新点
本实验的特色之处在于运用CRISPR进行基因的敲除。它不像其他基因编辑手段，它使用起来廉价、迅速且简单。相比于需要花费5000多美元才能订购到锌指核酸酶，CRISPR的全部花费只有30美元。而且只需要依靠一种利用引导性RNA分子将其导向目标DNA，就能编辑DNA以扰乱基因或插入想要的序列。在基因敲除的领域，CRISPR方法相比于别的方法更高效，便捷，经济，使在更多生物体中编辑基因成为可能。
5. 研究计划与进展
本实验的研究计划及预期进展是在未来的两个月以内选择某一特定的基因进行基于CRISPR系统的基因无痕敲除并验证。预计完成三个重复实验，对实验结果进行统计，计算基于CRISPR系统的基因无痕敲除效率。
