1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
酯酶生物催化剂在食品行业针对营养改善，形成风味，和食品发酵有广泛应用。酯酶的独特性能，在几种有机溶剂存在下，高的热稳定性和稳定性，可以使它在食品工业中应用前景广泛的酶。基因定点突变技术可以有目的地在已知dna序列中取代、插入或删除特定的核苷酸。由于突变的定向性、取代残基的可选择性、对高级结构的无(少)干扰性、检验手段的可靠性，与其他技术相比，定点突变技术显得准确而有效。本文主要讨论基因定点突变对酯酶生物活性的影响研究，旨在得到新型酯酶的生物合成信息，从而进一步得到能运用于食品工业生产营养全面，风味独特发酵食品的新型酯酶。
参考文献：
〔1〕陈木妹,林琳.d92p点突变对扩展青霉碱性酯酶最适作用温度的改善〔j〕.生物技术通讯,2005,16(001):31-33.
2. 研究的基本内容和问题
蛋白质设计最常用的方法可以概括为两种:一种是理性设计,而另一种为非理性设计。理性设计首先要建立在蛋白质三维结构已知的条件下,然后结合生物信息学的知识,利用计算机模拟酶的作用方式,分析其分子结构与功能之间的关系,确定可以修饰的氨基酸位点,最后通过对基因序列的了解,利用定点突变对指定的氨基酸进行碱基替换。非理性设计又叫定向进化,不需要事先了解蛋白质的空间结构,在实验室模拟自然进化机制(随机突变、基因重组等),通过易错PCR及DNA重组等方法对靶基因进行任意突变和重组,再通过建立有效的高通量筛选方法,筛选出优良的突变菌株。这两种方法都有其局限性,理性设计必须以已知的蛋白质三维结构做基础,而定向进化则需要建立高效的高通量筛选方法。目前这两种方法都广泛应用于酯酶改造中的应用现状、存在问题以及前景。
3. 研究的方法与方案
1 \理性设计对酶的改造:应用现状、存在问题
1.1 改变酶的稳定性酶的稳定性包括热稳定性,在有机溶剂中的稳定性等。蛋白质的热稳定性是其所有共价和非共价结合力的综合体现,影响因素较多,包括疏水作用,氢键、盐键及共价键的稳定等,一般考虑降低折叠与非折叠的熵差,以减少非折叠的构象;通过残基替换稳定α-螺旋及环等二级结构;增强疏水内核;增加残基间的氢键数;介入盐桥或盐桥网增加分子表面残基间的静电作用等,通常情况下,只定点突变一两个残基是很难大幅度提高酶的热稳定性的[1-5]分别构建了定点突变k55r、p197e、k202a与随机突变体ep8的重组体,叠加突变酯酶其热稳定性均仅比野生型酯酶提高2℃多,其热稳定性高并不明显。gianluca santarossa等[6〕对pseudomonasfragi酯酶的盖子区域进改造,将t137、t138和s141分别定点突变成同源酯酶相应位置的保守氨基酸v、n、g,发现t137v及t138n突变酯酶热稳定性增加,而s142g热稳定性低。ljudmila kulakova等〔7〕利用定点突变psychrobactersp.ant300酯酶基因活性位点附近的gly244突变为pro,极大地提高了其热稳定性,野生型酯酶在低温下(5℃～25℃)具有高催化活性,突变体酯酶40℃的半衰期由16min提高到11.6h。由于脯氨酸构型自由度较小,其吡咯烷环使β转折或无规卷曲结构更稳定,增加酯酶空间结构的刚性,从而提高热稳定性。脯氨酸是与热稳定性密切相关的一种氨基酸。takuya kawata等〔8〕为提高pseudomonasaeruginosalst-03酯酶在有机溶剂中的稳定性,利用定点突变,构建了s155l、g157r、s164k、s194r和d209n几个突变菌,发现突变酯酶在有机溶剂中的稳定性都比野生型酯酶高。这些突变使其结构发生改变,例如形成盐桥、氢键,进而造成疏水性中心的重排,这些改变提高了酯酶在有机溶剂中的稳。
2.2 改变酶的活性酯酶的盖子区域酶活具有重要的影响。通过计算机模拟,对proteussp.lipk107酯酶的盖子区域进行定点突变,突变体e130l k131i及突变体t138v酯酶的盖区域疏水性增强,其酶活也显著增强;而突变体i128e v129d酯酶盖子区域的疏水性减弱,其酶活也相应降低;可推测盖子结构的疏水性强弱对酶活有重要影响〔9〕。酯酶盖子区域的phe181和phe182定点突变为ala,f181a突变提高了酯酶对不同链长三酰基甘油底物的活性;f181a-f182a突变极大降低了酯酶的酶活,由其极大减少了苯丙氨酸的苯基和三酰基甘油的酰基侧链的范德华力,而范德华力是使底物的酰基侧链保持在活性位点的主要作用力。不仅可以利用定点突变对酯酶进行改造来改变酯酶的酶活,还可以利用定点突变使酯酶的酶活剧烈降低来确定某种酯酶的活性中心位点。以pseudomonassp.mis38酯酶(pml)为例。为了验证ser207是否为活性位点残基,kei amada等利用定点突变将ser207突变为ala,酯酶突变体对于底物橄榄油和p-硝基苯基葵酸盐的酶活还不到野生酯酶的0.2%和0.003%,即突变酯酶几乎没有酶活,而且圆二色光谱显示突变酯酶的空间结构并没有发生太大变化,与野生型的几乎一致。由此看出,ser207是pml的活性中心位点〔11〕。此外,一般酯酶或酯酶的催化三联体为ser,asp/glu和his,因此pml必有催化活性中心his和酸性氨基酸残基在ser207附近,将保守的五个his残基(his30、his274、his291、his313和his365)以及五个酸性氨基酸残基(glu253、asp255、asp262、asp275和asp290)定点突变为ala,仅his313ala和asp255ala突变酯酶几乎没有酶活,而其他突变对酯酶的酶活影响不大,圆二色光谱显示his313ala和asp255ala突变酯酶三维结构没有太大变化,即突变菌没有酶活并不是因为酯酶的空间结构发生了巨大变化,故可认为ser207,asp255和his313构成了pml的催化三联体〔12〕。另外,通过定点突变可以分析某些保守氨基酸对酯酶作用的影响。为了验证gly311在staphylococcusxylosus酯酶中的重要作用,habib mosbah〔13〕等将gly311分别定点突变为leu、trp、asp和lys,结果,酯酶突变体的酶活都降低了。mitsuru haruki等〔14〕也通过定点突变分析了escheri chiacoli酯酶(ece)的保守氨基酸(his103、glu128、gly163、asp164、ser165、gly167、asp262、asp266和his292)的作用,这些保守氨基酸对酯酶的酶活都有重要影响,对这些氨基酸进行突变,其酶活都降低了。
4. 研究创新点
酯酶普遍存在于动植物、微生物及人体中,在工业上用途广泛。
但由于诸多原因,真正应用于工业上的酯酶并不多。
利用理性设计,可针对工业上的特殊要求,选择适合人们需要的酶进行改造,得到性质更为适用的酶,使酯酶在工业上得到更广泛的应用。
5. 研究计划与进展
国内外有相当一些文献报道了定点突变后酯酶酶学特性的改变,但是,突变体酶学性质的改变良莠不齐。例如对于改变酶的最适温度和pH的文献报道不多,改善结果也不明显等。这些有待于将来的进一步研究。随着对酯酶及其他酶蛋白晶体结构研究的不断深入,人们对越来越多酶的3D结构更为了解,理性设计等蛋白质工程技术在酯酶及酯酶的改造中将会得到更为广泛的应用。另外,如Genbank、Swiss-Prot及PDB(ProteinDataBank)等数据库的迅速发展及成熟,也为蛋白质同源建模提供了便捷,从而为酶蛋白分子的改造提供更多更好的结构模型并有利于相关酶蛋白性质的定向改造。
