牛胰脏组织蛋白酶L的酶学特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

牛肉具有高蛋白质、低脂肪、低胆固醇的特点，其氨基酸组成接近于人体需要。我国有着丰富的牛肉品种资源，跟猪肉不同，食用牛肉很少受到民族风俗的限制。随着工业化、城镇化进程的加快，城乡居民经济收入的普遍提高，膳食结构的日益改善，人们对牛肉的需求数量不断增加，质量要求也越来越高。在我国，牛肉是仅次于猪肉、禽肉的第三大肉食品种，也是2000多万穆斯林人口的主要肉食来源。据预测，2020 年国内牛肉需求总量将达到1401万吨，人均9.41千克^[1]。

肉的食用质量指标主要包括滋味、质地、多汁性和气味等，其中以代表质地品质的嫩度最为重要，消费者常以嫩度来判断肉质的优劣^[2-4]。肉的嫩度是指肉入口咀嚼的整体印象，包括三个方面感觉，第一是入口开始咀嚼时，是否容易咬开;第二是否容易被咀嚼碎;第三咀嚼后留在口中的残渣量^[5]。不同解剖部位牛肉嫩度不同是由于肌肉结构成分的差异，其中主要的就是肌原纤维蛋白和结缔组织蛋白。结缔组织肌内膜将肌肉分成纵向肌束的组织状态，肌束的粗细不仅决定于肌束中肌纤维的数量，而且也决定于每条肌纤维的粗细，肌肉的质构随着动物年龄的增加而变粗，肌原纤维中的肌球蛋白、肌动蛋白及肌动球蛋白均可影响其嫩度,特别是肌球蛋白^[6]。同时，肌束表面的肌束膜的厚度同样对牛肉的嫩度有影响^[7]。

嫩度是决定牛肉食用品质的重要因素，也是消费者最关注的感官指标之一。嫩度的提高可以通过成熟改善，即在0～4℃条件下冷藏胴体的方法实现。研究者们普遍认为肌原纤维中骨架蛋白的降解在肉的成熟嫩化过程中贡献最大^[2,3]。目前研究发现，起主要作用的两种蛋白水解系统是钙激活酶（calpain ) 和组织蛋白酶（cathepsin) 。组织蛋白酶是一类存在于溶酶体中的酸性蛋白酶，它是多种酶的混合体，其中组织蛋白酶l、b、h、d 被认为与肌肉成熟有密切关系^[4]，来源于不同物种和细胞质的溶酶体组织蛋白酶具有类似的特性，它们都是分子量较小的蛋白质（20-40kda），在酸性ph值下有最大活性，在中性或者碱性条件下不稳定。其中，组织蛋白酶l是极其重要的溶酶体型半胱氨酸蛋白内肽酶，是在宰后引起肌肉降解主要的酶类之一，但组织蛋白酶l的内肽酶活性远高于组织蛋白酶b、d、h，即使在多次漂洗之后，鱼肉组织蛋白酶l（cathepsin l，ctsl）仍有较高残存活性。目前，研究主要集中于鱼类，已从鲤鱼、小鼠、牦牛等中提取了组织蛋白酶b、l^[5,6]。关于牛胰脏中组织蛋白酶l 的研究国内外还尚未见报道。本研究以牛胰脏为研究对象，从中提取组织蛋白酶l 并对其酶学性质进行研究，以期为纯化组织蛋白酶l提供条件，为进一步研究牛肉的成熟机制以及提高牛肉品质奠定理论基础。

2. 研究的基本内容和问题

课题研究内容：

通过从牛胰脏中提取组织蛋白酶l，并进行相关酶活实验，以期为纯化组织蛋白酶l提供条件，进一步研究组织蛋白酶l在牛肉中的成熟机制以及对牛肉品质的影响奠定理论基础。

需要实现的目标：

3. 研究的方法与方案

1提取方法 牛胰脏提取物的提取根据poter等的方法^[7]略作调整。剥除牛胰脏多余脂肪和结缔组织，切块，取350g，捣碎。加入4倍体积的提取缓冲液（25 mmol/l ch₃coona、5mm mmol/l、0.3 mmol/l pmsf），利用waring blender 7000rpm/min匀浆1.5min后，10,000 g离心20min，上清用四层纱布过滤除去表层脂肪，得上清液。用1n hcl调整ph至3.0，30℃下处理10min，后用1n naoh将酶液ph回调至5.8~6.0，立即以10,000g离心20min。取上清用饱和度为80%的硫酸铵盐析，静置3h, 10,000g离心20min取沉淀，用透析缓冲液（含5 mmol/l l-cys的20 mmol/l 磷酸盐缓冲液，ph 6.0）溶解，10,000g离心20min，去除沉淀变性蛋白，取上清液，透析超滤浓缩得粗酶液，于-80℃冷冻保存，为保证其中酶的活性，试验最高保存期为15天。

2提取物中组织蛋白酶l活性测定

组织蛋白酶l的反应缓冲液：340mmol/l ch₃coona-60mmol/l ch₃cooh- 4mmol/l na₂-edta （ph5.5），使用前配制成含8mmol/l dtt的新鲜溶液。

底物配制：用dmso配制成10mmol/l的贮备液，-20℃保存。使用前用双蒸水稀释成20μmol/l (底物必须新鲜)。

4. 研究创新点

1． 从牛胰脏中提取组织蛋白酶L，优化提取方法并进行相关酶学特性研究，为进一步研究牛肉的成熟机理提供理论依据。

5. 研究计划与进展

2013年11月，相关文献阅读，资料查阅，技能学习及材料准备

2013年12月,收集资料，制定总体方案，并与指导教师讨论,并进行相关预实验

2014年2月-2014年3月，采购牛胰脏，进行酶的粗提和相关酶学特性研究