1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1 本课题的意义
由于虾类固有的生物和生物化学特性（含水77%，蛋白质20.6%），使得其在储藏、运输、加工及销售过程中很容易腐败变质，严重影响它的经济价值和营养价值，虾类的保鲜问题是食品科学研究的重要课题，关于虾类的保鲜，国内外已有研究文献报导[1-5]。传统的新鲜虾类保鲜方法是采用低温保存，但由于虾类自身存在多酚氧化酶的，这种酶在虾类冷冻、冰藏和解冻期间仍然保持着活性，致使虾类在加工、储藏、运输过程中都难以避免地发生褐变，因此对虾类保鲜来说防褐变是非常重要的[6]。
2. 研究的基本内容和问题
2.1 研究的目标
本实验通过测定对比经葡萄糖氧化酶类保鲜剂处理过后保藏一定时间的鲜虾的总体感官评价、挥发性盐基氮（tvb-n）、ph值、组胺含量、细菌总数（tvb），从而判断各保鲜剂对于鲜虾的保鲜效果。通过研究分析所得的各项数据，为研究葡萄糖氧化酶在鲜虾保鲜中的作用提供实验依据，确认其实际应用。激发大学生主动学习探索的兴趣，培养自主创新的实验探究能力。
2.2 研究内容
3. 研究的方法与方案
3.1 研究方法
进行葡萄糖氧化酶类保鲜剂的单因素实验，仅设置一组实验组合一组对照组（蒸馏水），将鲜虾用葡萄糖类保鲜剂和水分别处理后，经一定时间的冷藏，在冷藏过程中按照预定的时间间隔分别测量两组的总体感官评价、挥发性盐基氮（TVB-N）、ph值、组胺含量以及细菌总数（TBC）并记录分析数据，通过对比探明葡萄糖氧化酶类保鲜剂在保藏过程中对鲜虾的影响以及效果，最终得较好的葡萄糖氧化酶应用于鲜虾保鲜的保藏方案。
3.2 技术路线
3.3实验方案
3.3.1 供试材料与实验用品
材料：鲜活虾
试剂： 葡萄糖氧化酶类保鲜剂、蒸馏水、氧化镁混悬液（10g/L）、硼酸吸收液（20g/L）、0.01mol/L盐酸、甲基红-乙醇指示剂（2g/L）、次甲基蓝指示剂（1g/L）(两指示剂临时等量混合使用)、正戊醇、三氯乙酸溶液（100g/L）、碳酸钠溶液（50g/L）、氢氧化钠溶液（250g/L）、组胺标准储存液、磷酸标准使用液、偶氮试剂（甲、乙）、琼脂培养基、无菌生理盐水等
仪器：半微量定氮器、微量滴定管（最小分度为0.01ml）、酸度计、离心机、比色管、平板等
3.3.2实验方法
（1）材料准备：购买新鲜的活虾；
（2）试剂准备：配制或购买葡萄糖氧化酶类保鲜剂；
（3）处理：选用鲜活虾，随机挑选鲜度一样的对虾，分两组组，每组2.0kg，清水洗净后，用葡萄糖氧化酶类保鲜剂50g/ml浸泡处理3min，并以蒸馏水作空白对照。然后在筛绢上滤去浸泡液，装入保鲜盒中，
（4）冷藏：置于冰箱4℃冷藏，共储藏4个月。
（5）测量：每隔15天对保藏鲜虾进行总体感官评价，并测量其挥发性盐基氮（TVB-N）、pH值、组胺含量以及细菌总数（TBC）。
①感官评价
| 冷藏甲壳类（虾） | ||
|
生鲜 | 外观（带壳） | 色泽鲜亮、固有颜色、水锈、微黑、黑斑、黑箍、头和身体呈黑色 |
| 外观（去壳） | 半透明、全日或浅灰、轻微变黑、严重变黑，非常透明、黏滑 | |
| 气味 | 新鲜、海腥味，霉味、氨味、酸味、腐败、腐臭 |
②挥发性盐基氮（TVB-N）
半微量定氮法
原理：挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的作用,在腐败过程中,使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性,在碱性溶液中蒸出后,用标准酸溶液滴定计算含量。
1）试样处理:将试样除去外壳后，绞碎搅匀，称取约10.0 g,置于锥形瓶中，加100 ml水,不时振摇,浸渍30min后过滤,滤液置冰箱备用。
2）蒸馏滴定:将盛有10mL硼酸吸收液及5滴~6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端,并使其下端插入吸收液的液面下,准确吸取5.0mL上述试样滤液于蒸馏器反应室内,加5 mL氧化镁混悬液(10g/L),迅速盖塞,并加水以防漏气,通人蒸汽,进行蒸馏，蒸馏5min即停止,吸收液用盐酸标准滴定溶液(0.010mol/L),终点至蓝紫色。同时做试剂空白试验。
3）计算：
试样中挥发性盐基氮的含量按下式进行计算。
X ——试样中挥发性盐基氮的含量,单位为毫克每百克(mg/100 g);
V1——测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液体积,单位为毫升(mL);
V2——试剂空白消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，单位为毫升(mL);
c ——盐酸或硫酸标准溶液的实际浓度,单位为摩尔每升(mol/L);
14——与1.00 mL盐酸标准滴定溶液[c(HCl)=1.000 mol/L]或硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=1.000mol/L]相当的氮的质量,单位为毫克(mg);
m——试样质量,单位为克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
③pH值
采用酸度计直接测量。
称取10.00g绞碎试样,加新煮沸后冷却的水至100mL,摇匀,浸渍30min后过滤或离心，取约50 mL滤液于100 mL烧杯中,用酸度计测定pH值。
计算结果保留二位有效数字。
④组胺含量
原理：鲜虾中组胺用正戊醇提取,遇偶氮试剂显橙色,与标准系列比较定量。
1）试样处理：称取5.00g~10.00g绞碎并混和均匀的试样,置于其塞锥形瓶中,加入15mL~20mL三氯乙酸溶液,浸泡2h~3h,过滤。吸取2.0mL滤液,置于分液漏斗中,加氢氧化钠溶液使呈碱性，每次加人3mL正戊醇，振摇5min,提取三次,合并正戊醇并稀释至10,0mL。吸取2.0mI, 正戊醇提取液于分液漏斗中，每次加3mL盐酸(1 11)振摇提取三次，合并盐酸提取液并稀释至10ml备用。
2）测定：吸取2.0ml,盐酸提取液于10 mL比色管中,另吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mL.组胺标准使用液(相当于0、4.0、8.0、12、16、20μg组胺),分别置于10mL.比色管中,加水至1 mL,再各加1mL,盐酸(1 11)。试样与标准管各加3 mL碳酸钠溶液(50g/L),3mL偶氮试剂,加水至刻度,混匀,放置10min后用1cm比色杯以零管调节零点,于480nm波长处测吸光度,绘制标准曲线比较，或与标准系列目测比较。
3）计算
试样中组胺的含量按下式进行计算。
X——试样中组胺的含量,单位为毫克每百克(mg/100 g);
Vt——加人三氯乙酸溶液(100g/L)的体积.单位为毫升(mL);
m1——测定时试样中组胺的质量,单位为微克(pg);
m2——试样质量,单位为克(g)
计算结果表示到小数点后一位。
④细菌总数（TBC）
平板计数法
1）稀释：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，稀释105~107倍。
2）培养：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h。
3）计数：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。
计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字。
若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。
（6）根据所得数据分析整理，得出结论。
3.4 可行性分析（1）不同保鲜试剂处理过的鲜虾保藏效果具有显著差异。
（2）指导老师对葡萄糖氧化酶对鲜虾保鲜的研究具备丰富的经验以及良好的实验条件。
（3）实验人员从受指导老师指导，掌握葡萄糖氧化酶的反应机理以及性质、结构等，同时对判断鲜虾保藏效果各项指标有较深了解，有良好的实验基础。
（4）本课题依托南京农业大学吕凤霞教授的创新团队，设备完备、精良，此外课题研究具有经费和场地的保障。
4. 研究创新点
4.特色或创新之处
鲜虾这类水产保鲜在食品安全研究中越来越受重视，但对于葡萄糖氧化酶在这类水产保鲜的应用领域国内外的研究均较少。本实验通过研究葡萄糖氧化酶类保鲜试剂在保藏鲜虾的整个过程发挥的作用和效用，探究其最佳的保鲜方案，为水产保鲜这一行业，乃至葡萄糖氧化酶这类生物酶在保鲜方面的研究提供一定的思路。5. 研究计划与进展
5.1研究计划
2020.02.27日 准备实验用的材料与试剂，待用；
2020.03.01日 用葡萄糖氧化酶类保鲜剂和在蒸馏水处理鲜虾后冻存；
