1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1课题的意义 规律性的成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, crispr),是常见于细菌与古细菌中的一种免疫系统,能够有效的抵御病毒和外源物质的入侵[1]。
基因编辑是对生物体基因组或者转录产物进行定点修饰或者修改的基因工程技术。
科学家创造性的利用crispr的特性，将其应用于基因编辑技术，相较于传统编辑方法,具有简单高效、应用广泛、编辑成功率高的特点[2]。
2. 研究的基本内容和问题
1研究目标 本研究拟构建可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中穿梭表达的新型编辑蛋白酶FnCpf1载体，通过软件设计得到满足要求的目的质粒图谱，并连接各结构DNA片段得到重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌并提取获得大量目的质粒。重组质粒转化到枯草芽孢杆菌中表达，并测定目的效应蛋白FnCpf1的表达水平以及活性。要求该载体能在枯草芽孢杆菌中高效表达效应蛋白，以满足后续精确实现基因编辑功能和菌株改造的需要。2研究内容2.1 新型基因编辑蛋白酶FnCpf1载体的设计 CRISPR/Cas系统进行宿主细胞基因组编辑功能需要外源编辑蛋白酶表达。所以，如何将外源基因导入宿主细胞至关重要。本研究选取质粒作为外源基因的载体，将外源CRISPR/ FnCpf1转化进入宿主细胞并高效表达蛋白酶。质粒作为载体要求有完整的复制起点、抗性标记基因和复制终点。课题设计质粒为穿梭质粒，可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种微生物中克隆和表达，因此具有两套不同的表达体系，使质粒大小增加。质粒越大组成越复杂对宿主细胞的压力就越大，会影响质粒的复制与表达。所以，在质粒设计阶段要既满足要求又尽可能的简化质粒组成与结构，使质粒在大肠杆菌中拷贝数高，在枯草芽孢杆菌中有较高的表达水平。2.2 FnCpf1载体的获得 载体由行使不同功能的DNA片段组成，研究中需要对这些片段准确连接以得到与设计图谱相同碱基序列的重组质粒。DNA的连接有不同的方法，所以研究中拟选择Infusion法对不同的片段连接，转入大肠杆菌中筛选鉴定出重组质粒。2.3 编辑蛋白酶FnCpf1表达水平测定 本课题构建的载体要求能在枯草芽孢杆菌中高效表达编辑蛋白酶FnCpf1，以满足后续精确实现基因编辑功能和菌株改造的需要。课题研究中，需要将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌中进行诱导发酵，并提取纯化FnCpf1，测定表达水平与活力。3拟解决的关键问题 外源基因的表达受到多种因素的影响，培养基种类、菌体浓度、发酵温度时间、诱导剂浓度等条件都会影响FnCpf1在宿主细胞中的表达水平。所以，课题研究中拟解决FnCpf1表达条件的优化问题。通过实验确定表达水平最高时的菌体浓度、诱导剂浓度、培养的温度与时间。
3. 研究的方法与方案
1研究方法
2 技术路线
3 试验方案
3.1使用Snapgene设计目的质粒得到质粒结构与图谱，设计引物，重组质粒包括FnCpf1片段、CRISPR片段和载体片段。
3.2 PCR法获得扩增所需DNA片段。
3.3用胶回收试剂盒提纯得到各片段DNA。3.4 用Infusion法结合交错延伸PCR法连接各DNA片段，得到线性质粒。3.5质粒环化，大肠杆菌DH5α转化、克隆并筛选出含重组质粒的菌落，酶切检验和测序结合检验碱基顺序是否与图谱相同。3.6 枯草芽孢杆菌（B.S.168）电转化吸收重组质粒，包括感受态细胞的制备与电转化工作。3.7菌落PCR法筛选出含重组质粒的枯草芽孢杆菌菌落。3.8发酵筛选得到的枯草芽孢杆菌菌落，用IPTG诱导表达编辑蛋白酶FnCpf1。3.9提取纯化效应蛋白，用SDS-PAG法检验蛋白酶的表达水平，并测定活力。3.10改变不同的发酵条件，优化蛋白酶FnCpf1的表达。分析实验结果。4 可行性分析4.1 实验技术的可行性 实验方案参考大量相关文献，符合该类型课题研究原则。方案合理严谨，切实符合不同实验阶段的工作，能够确保课题研究顺利完成，具有实验技术可行性。4.2实验条件可行性 课题研究在食品楼酶工程实验室进行，实验室具有完备的仪器与设备，具备课题所需的科研条件，能够确保课题顺利进行，具有实验条件可行性。 综上，该课题研究具备可行性，能够完成课题。
4. 研究创新点
首先，CRISPR/FnCpf1编辑系统尚未有在枯草芽孢杆菌中应用的报导，所以本课题的研究和载体的构建在为该编辑系统应用于枯草芽孢杆菌做前期工作。其次，实验中使用Infusion法将目的基因与载体连接，不同于传统连接方法。该方法不需要限制性内切酶将两者酶切具有相同的黏性末端，Infusion法可以将两个线性DNA片段连接，快速便捷充足率高。同时，CRISPR编辑技术从2015年公开发表开始，就打开了新型基因编辑的大门，是最新一代编辑技术，得到国内外众多科学家的青睐，这是本课题的创新之处。
5. 研究计划与进展
1 研究计划2019.09-2020.01：阅读大量文献，学习crispr相关知识，了解crispr/cas系统的结构组成。
学习并熟练掌握课题相关软件如snapgene的使用，独立完成目的质粒和pcr引物的设计，并与导师确认，使设计结果符合课题要求。
准备好构建载体所需的质粒和菌株。
