1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.研究意义
1.1 A型流感病毒及跨种间传播
流感病毒根据其核蛋白和膜蛋白1抗原性分为A、B、C、D共 4型，其中A型流感病毒宿主范围最广、抗原变异性高、感染性和致病性强、进化和传播速度快[1]，是20世纪至今多次全球性人流感和禽流感的主要病原，对人类健康造成极大威胁。因此A型流感病毒的研究是流感病毒领域的热点。
有效防控A型流感病毒是流感病毒研究的重要目标，但该病毒跨物种传播特性为防控带来巨大困难。A型流感病毒抗原漂移使病毒在宿主体内稳定存在，为跨种传播打下基础。A型流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成，HA、NA节段分别编码糖蛋白血凝素和神经氨酸酶，二者分别占病毒表面蛋白总量的80%和17%[2]。由于RNA酶在复制过程中缺乏校正功能，病毒在增殖过程中基因组易发生突变即抗原漂移，以HA和NA的突变率最高[3]。病毒在宿主免疫压力下点突变积累，导致抗原性改变，宿主原有抗体失效，形成流感病毒暴发与持续流行。A型流感病毒基因重配产生新毒株，特别是HA、NA节段的重配，可直接导致病毒宿主谱改变，实现跨种传播。HA蛋白的受体结合区域宿主细胞表面的唾液酸受体结合，决定病毒的宿主嗜性和病毒黏附[4]。NA蛋白具有糖苷酶活性，通过水解细胞唾液酸受体末端的N-乙酰神经氨酸促使子代病毒释放[5]。1957年亚洲流感、1968年香港流感的病原是毒禽流感病毒与人流感重配产物；2009年流感疫情的病原是禽流感病毒、猪流感病毒、人流感病毒三源重配病毒[6, 7]。近20年，禽流感频繁跨种感染哺乳动物，1997年香港禽流感致人感染、2013年上海人感染H7N9禽流感病毒等事件，均引起极大关注。
1.2 犬流感及公共卫生危害
犬曾长期未在A型流感病毒易感动物之列，人工感染试验也未发现病毒可在犬中流行[8]。因此，研究普遍认为流感病毒不能在犬体内形成稳定株系也无法在种内持续传播。但是2004年美国赛犬业暴发H3N8亚型流感、2007年韩国多品种犬暴发H3N2亚型流感，且病毒在犬群间持续传播，故犬流感（canine influenza virus,CIV）成为新发的传染病[9]。相比其他宿主，犬作为我国数量最高的伴侣动物，随着宠物市场进入高速发展期，人与犬的接触日益频繁，犬流感对公共卫生的危害值得重视。
综上，开展犬流感的监测，从分子水平及时了解病毒变异情况，不仅丰富犬流感和流感病原学储备，而且对防控犬流感致人感染、及时预警犬流感病毒参与的跨种传播提供帮助。
2.国内外研究进展
H3N8亚型犬流感病毒于2004年1月首次在美国赛犬成功分离，截至2009年美国在30个州分离到H3N8病毒[10]。系统进化分析显示分离株源自90年代美国的H3N8马流感病毒，但犬分离的所有毒株已形成新的进化分支[11]。基因序列分析表明犬流感分离株的HA节段与同源性最高的马流感HA节段比对，受体结合区域发生突变[12]，导致马流感病毒获得结合犬呼吸道受体的能力，进而得出犬流感的形成原因：赛犬与马共用竞技场造成犬接触马源H3N8流感病毒，病毒在犬体内产生适应性抗原漂移使之在犬群间稳定存在并继续传播，形成H3N8犬流感病毒。
2.2 东亚地区犬流感病毒的分离
2007年在韩国分离到H3N2亚型犬流感病毒。基因序列分析显示韩国分离株的8个节段均来自禽流感病毒，其中HA、NA节段源自韩国地区禽流感毒株，其余6个节段来自中国禽流感毒株[13]。中国同年在广东的兽医诊所首先分离到H3N2亚型犬流感病毒，病毒随后向北扩散至江浙一带和东北地区[14, 15]。与北美相比，东亚地区农场犬的感染率高于宠物犬，表明东亚犬流感形成过程主要为：农场给犬饲喂带毒鸡鸭导致禽源流感病毒长期感染犬，病毒在犬体内不断适应进化，逐渐形成犬流感病毒[16]。
最近，又陆续在中国的犬体内分离到H1N1、H5N1、H9N2亚型流感病毒，其中H1N1亚型毒株与人群中流行的病毒同源性极高，对人类健康的威胁值得重视。由于对犬流感病毒的研究起步很晚，近年的研究表明多种动物源的流感病毒均可以感染犬，因此对犬流感病毒进行检测和序列分析，掌握犬流感病毒进化方向十分重要。
3.应用前景
3.1 犬流感病毒的诊断
目前用于诊断的方法有病毒分离培养、血清学诊断、PCR技术检测病毒基因。病毒分离培养对实验室资质要求高，需要3-5d才能得出结果；血清学诊断所需时间太长，难以及时诊断急性期病例[17]。PCR技术可直接从分泌物中检出流感病毒基因，具有以下优点：敏感、快速，可对潜伏感染进行诊断。故开展犬流感PCR法检测，并对犬流感病毒变异率最高的HA、NA序列进行分析，可以为改进PCR检测的目的序列、提高检测灵敏度、降低假阳性提供依据。
3.2 犬流感病毒的预防和治疗
治疗流感主要使用抗病毒药和光谱抗菌药。目前，常用的抗病毒药物金刚烷胺、达菲均未许可用于犬[18]，抗菌药治疗可以控制并发细菌感染，但无法彻底杀灭犬流感病毒。因此，免疫预防对于控制犬流感至关重要，而疫苗接种是首要
措施。当下主要有根据病毒HA基因的制备重组活载体疫苗，根据纯化病毒制备的灭活疫苗、单克隆抗体疫苗[19-21]。上述疫苗的保护率均与病毒基因节段的突变相关，因此，及时对流行毒株进行检测、关键节段测序和序列分析，有助于及时制备针对新变异病毒的疫苗，在新毒株感染犬群早期进行免疫预防，控制新毒株蔓延。
2. Nayak DP, Balogun RA, Yamada H, Zhou ZH, Barman S. Influenza virus morphogenesis and budding. Virus research 2009; 143(2):147-161.
3. Xu R, Ekiert DC, Krause JC, Hai R, Crowe JE, Jr., Wilson IA. Structural basis of preexisting immunity to the 2009 H1N1 pandemic influenza virus. Science (New York, NY) 2010; 328(5976):357-360.
4. Huang Q, Sivaramakrishna RP, Ludwig K, Korte T, Bottcher C, Herrmann A. Early steps of the conformational change of influenza virus hemagglutinin to a fusion active state: stability and energetics of the hemagglutinin. Biochimica et biophysica acta 2003; 1614(1):3-13.
5. Palese P, Tobita K, Ueda M, Compans RW. Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase. Virology 1974; 61(2):397-410.
6. Viboud C, Simonsen L, Fuentes R, Flores J, Miller MA, Chowell G. Global Mortality Impact of the 1957-1959 Influenza Pandemic. The Journal of infectious diseases 2016; 213(5):738-745.
7. Veljkovic V, Paessler S, Glisic S, Prljic J, Perovic VR, Veljkovic N, et al. Evolution of 2014/15 H3N2 Influenza Viruses Circulating in US: Consequences for Vaccine Effectiveness and Possible New Pandemic. Frontiers in microbiology 2015; 6:1456.
8. Dubovi EJ, Njaa BL. Canine influenza. The Veterinary clinics of North America Small animal practice 2008; 38(4):827-835, viii.
9. Harder TC, Vahlenkamp TW. Influenza virus infections in dogs and cats. Veterinary immunology and immunopathology 2010; 134(1-2):54-60.
10. Crawford PC, Dubovi EJ, Castleman WL, Stephenson I, Gibbs EP, Chen L, et al. Transmission of equine influenza virus to dogs. Science (New York, NY) 2005; 310(5747):482-485.
11. Payungporn S, Crawford PC, Kouo TS, Chen LM, Pompey J, Castleman WL, et al. Influenza A virus (H3N8) in dogs with respiratory disease, Florida. Emerging infectious diseases 2008; 14(6):902-908.
12. Nakajima K, Nobusawa E, Tonegawa K, Nakajima S. Restriction of amino acid change in influenza A virus H3HA: comparison of amino acid changes observed in nature and in vitro. Journal of virology 2003; 77(18):10088-10098.
13. Song D, Kang B, Lee C, Jung K, Ha G, Kang D, et al. Transmission of avian influenza virus (H3N2) to dogs. Emerging infectious diseases 2008; 14(5):741-746.
14. Su S, Chen Y, Zhao FR, Chen JD, Xie JX, Chen ZM, et al. Avian-origin H3N2 canine influenza virus circulating in farmed dogs in Guangdong, China. Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases 2013; 19:251-256.
15. Sun Y, Sun S, Ma J, Tan Y, Du L, Shen Y, et al. Identification and characterization of avian-origin H3N2 canine influenza viruses in northern China during 2009-2010. Virology 2013; 435(2):301-307.
16. Lee C, Song D, Kang B, Kang D, Yoo J, Jung K, et al. A serological survey of avian origin canine H3N2 influenza virus in dogs in Korea. Veterinary microbiology 2009; 137(3-4):359-362.
17. George KS. Diagnosis of influenza virus. Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 2012; 865:53-69.
18. 夏冰, 刘红彦, 胡国良, 曹华斌. 犬流感的研究进展及其公共卫生安全影响. 中国动物检疫 2014; (10):33-37.
19. Karaca K, Dubovi EJ, Siger L, Robles A, Audonnet JC, Jiansheng Y, et al. Evaluation of the ability of canarypox-vectored equine influenza virus vaccines to induce humoral immune responses against canine influenza viruses in dogs. American journal of veterinary research 2007; 68(2):208-212.
20. Rosas C, Van de Walle GR, Metzger SM, Hoelzer K, Dubovi EJ, Kim SG, et al. Evaluation of a vectored equine herpesvirus type 1 (EHV-1) vaccine expressing H3 haemagglutinin in the protection of dogs against canine influenza. Vaccine 2008; 26(19):2335-2343.
21. Xie X, Lin Y, Pang M, Zhao Y, Kalhoro DH, Lu C, et al. Monoclonal antibody specific to HA2 glycopeptide protects mice from H3N2 influenza virus infection. Veterinary research 2015; 46:33.
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
1.1 上海某动物医院2017年冬季犬流感疑似病例病原检测
本课题拟对2017年冬季上海某动物医院的犬流感疑似病例，即表现出湿性咳嗽、偶有干咳，同时伴有流鼻涕、流泪，精神萎靡等轻度症状或表现出不同程度的发烧及肺炎、咳血、呼吸苦难等重度症状，进行犬流感的病毒检测；以获得该医院犬流感阳性率等数据，为临床鉴别波氏杆菌性支气管炎提供信息。
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
1.1 病毒检测鉴定
1.1.1 病料采集与处理
使用采样拭子收集病犬鼻腔和口腔的液体，将拭子在含双抗的生理盐水和-80℃保存。
1.1.2 拭子液病毒检测
根据病毒8个基因节段的保守序列，设计反转录引物。用Trizol法从拭子液中提取病毒RNA，用反转录试剂盒、以病毒RNA为模板获得cDNA。根据病毒M节段基因的保守序列设计引物，以cDNA为模板PCR扩增该序列，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性拭子液。
1.2 病毒HA、NA全基因序列测定
1.2.1 HA、NA片段全长的扩增
根据HA、NA片段的保守序列设计引物，PCR全长扩增上述两片段。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定为阳性的目的片段用PCR产物回收试剂盒回收。
1.2.2 HA、NA克隆载体的构建与测序
将纯化回收的HA、NA片段与pMD19-T载体连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并在抗性平板上培养。随机挑取单菌落接种抗性LB培养液，以菌液为模板、以载体通用引物进行PCR检测，阳性菌液送公司测序。
1.3 HA、NA序列分析
使用ncbi网站对测序结果进行比对。用DNAstar和Megalign进行氨基酸序列比对。用MEGA4构建系统发育树。
2.技术路线
氨基酸位点变异分析 |
病料采集、处理与保存 |
病例信息登记 |
采集病例拭子液 |
低温运输与-80℃保存 |
病毒检测 |
RNA反转录获得cDNA |
从拭子液提取病毒RNA |
PCR扩增基质蛋白保守区 |
核酸电泳鉴定阳性 |
HA、NA全基因序列测定 |
PCR扩增HA、NA全基因 |
转化感受态并鉴定阳性菌液 |
基因测序 |
序列分析 |
序列比对 |
分别构建HA、NA克隆载体 |
进化分析 |
3.实验方案
3.1材料
3.1.1 病料
2017年11月至2018年3月，在上海一动物医院门诊病犬中，对症状为咳嗽、流鼻涕的病犬采集鼻咽拭子液。
3.1.3主要试剂与仪器
Trizol购自Invitrogen公司；Reverse Transcriptase M-MLV、dNTP Mixture、Premix Ex TaqTM Version 2.0 (Loading dye mix)、Premix PrimerStarHS、DL5000 DNA Marker、pMD-19T simple vector、T4 DNA Polytnerase、PCR Purification Kit等均购自TAKARA公司；大肠杆菌DH5α购自天根生化科技有限公司。主要仪器包括-80℃超低温冰箱、低温高速离心机、水浴锅、PCR仪、核酸凝胶电泳系统、凝胶成像系统等。
3.2方法
3.2.1病毒的检测
3.2.1.1病料的采集及处理
取采样拭子，将拭子配套的棉签在病犬鼻腔和口腔涂抹，让拭子充分吸收分泌物和液体，用终浓度为1000单位双抗的生理盐水浸泡拭子，充分涡旋震荡，用冰袋严密包裹拭子管邮寄。实验室收到后于-80℃超低温冰箱保存。
3.2.1.2病毒RNA的提取
按Trizol法提取病毒RNA：（RNA提取过程中所用到的所用到所有EP管和枪头均为DEPC水浸泡后高压）取研磨病料滤过物或病毒培养物，按Trizol∶细胞悬液为2：1加入Trizol试剂，上下振荡数次，静置 5min。加入等体积（600L）的氯仿，静置 5 分钟，200rpm离心 5min，吸取上清至另一试管。向上清液中加入 900l 的异丙醇，200rpm离心 15min 沉淀 RNA，倒掉异丙醇。加入 75%的乙醇 1ml，125rpm离心 5min，吸净乙醇后干燥备用。
3.2.1.3病毒RNA的反转录
采用20L反转录体系，反转录程序为：13.5L RNA，1L反转录引物，72℃10min，冰上放置2min；再加入0.5L MLV，1L dNTP，4L5Buffer，上述溶液混合均匀后于42℃1h，获得cDNA，于-20℃保存。
3.2.1.4 PCR检测
根据病毒M节段的保守区域设计引物用于cDNA检测。
采用20l反应体系：10L Taq mix (2)，7L ddH20，上、下游引物各1L，模板1L。扩增HA和NA节段过程均为：94℃预变性4min；进入循环程序：94℃30s， 51℃30s，72℃延伸4s，共30个循环；最后72℃延伸10min。扩增NA反
应结束后，取6L PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3.2.2 HA、NA全基因序列测定
3.2.2.1 HA、NA全基因扩增
根据HA、NA保守序列设计引物。采用100L反应体系分别扩增HA、NA全基因：50L PrimerStar mix( 2)，36L ddH20，上、下游引物各4L，模板6L。反应程序均为：94℃预变性4min；进入循环程序：94℃30s, 52℃30s, 72℃延伸108s，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后用PCR产物回收试剂盒回收目的片段，用微量定量仪测定目的片段浓度。
3.2.2.2 目的片段克隆载体的构建与测序
配制如下体系：片段4L，pMD19T-Vector 1L，Solution1 5L，16℃恒温1h，完成目的片段与pMD9-T载体的连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布氨苄抗性LB平板培养过夜。随机挑取部分单菌落，用氨苄抗性LB培养液37℃培养4h，以菌液为模板进行PCR检测，阳性菌液送南京擎科公司测序。
3.2.3 序列分析
使用NCBI网站对测序结果进行比对，确定HA、NA亚型。使用DNAstar、Megalign软件，对基因推导的氨基酸序列进行比对，获得各位点变异情况。使用MEGA4软件构建系统进化树。
4.可行性分析
4.1 实验环境完善
本课题所用实验室为OIE参考实验室，具备超低温冰箱等病料和试剂储存条件，具备RNA提取的专用设备和耗材，具备PCR操作的全套先进仪器，可最大程度降低病料损耗和污染。导师长期从事病原微生物方向的研究，经验充足，能够指导本课题开展。
4.2 流感病毒基因扩增技术成熟
A型流感病毒的基因扩增、测序已在全球多个实验室进行，引物设计日驱完善，测序技术非常成熟快速，为本研究的打下良好基础。
4. 研究创新点
犬流感是近年新确定的一种传染病，CIV的PCR检测方法建立较晚，本研究综合最近的检测方法和相关文献，用新的目的片段进行检测，简化检测过程，并验证该方法对最近流行的病毒是否有效，为发展CIV的检测技术提供信息。
关于犬流感病毒与其他A型流感病毒的分子差异、犬流感病毒的进化特征，目前的研究尚不够充分。本研究对上海一动物医院犬流感高发季节进行病毒监测，获得犬流感病毒的最新分子生物学特征，为该病的流行病学分析提供资料。
5. 研究计划与进展
第一阶段（2017.92017.10）学习实验室操作规范，完善实验设计、熟悉相关操作。
第二阶段（2017.112017.12）完成对2017年冬季犬流感疑似样品的病毒检测和基因测序。
第三阶段（2018.22018.4） 完成对2018年春季该医院的犬流感监测，对基因序列进行分析。
课题毕业论文、开题报告、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
